miR-125a-5p抑制肝细胞癌的发生

文章信息

1.研究背景

miR-125a-5p在肝细胞癌（HCC）和其他癌症中是一种肿瘤抑制因子，但在HCC肿瘤发生过程中其作用机理仍然未知。

2.方法

2.1 来自HCC患者的8对肝癌组织和邻近正常组织使用miRNA芯片（Shanghai Wcgene Biotech, Shanghai, China）比较miRNA的表达情况

2.2 细胞转染，对转染后的细胞进行qRT-PCR分析，CCK8和菌落形成试验，Western blot分析，以及免疫荧光分析。

2.3 利用数据库预测miR-125a-5p的靶基因

2.4 建立小鼠肿瘤模型

3.结果

3.1 miR-125a-5p在HCC组织和细胞系中下调

使用微阵列比较八对HCC组织和邻近正常组织中的miRNA表达。结果表明，与邻近的正常组织相比，HCC组织中的miR-125a-5p表达降低。此外，qRT-PCR表明miR-125a-5p在HCC细胞系（Bel-7404，SK-Hep1，Bel-7404和MHCC-97H）中的表达低于正常肝细胞系（L02）。

图1. （A）在八对匹配的HCC组织和相邻正常组织中差异表达的miRNA的热图。（B）qRT-PCR表明，与邻近的正常组织相比，HCC组织中的miR-125a-5p表达下调。（C）与Starbase中TCGA中相邻的正常组织相比，HCC肿瘤组织中的miR-125a-5p表达下调。（D）qRT-PCR表明，miR-125a-5p在HCC细胞系（Bel-7404，SK-Hep1，Bel-7404和MHCC-97H）中的表达低于正常肝细胞系（L02）。（E）Kaplan-Meier曲线表明，HCC患者的总体生存率与miR-125a-5p表达水平无关。

3.2 miR-125a-5p在体外抑制HCC细胞增殖并诱导其凋亡

分别通过用miR-125a-5p模拟物和抑制剂转染，在Bel-7404和SK-Hep1细胞中过表达和敲低miR-125a-5p。并通过qPCRC，CCK8和菌落形成分析，Western印迹和免疫荧光实验表明，miR-125a-5p在体外抑制HCC细胞的增殖并诱导其凋亡。

图2.（A）qRT-PCR显示，在Bel-7404和SK-Hep1细胞中，miR-125a-5p在用模拟物转染后被上调，而在抑制剂转染后被下调。（B和C）使用CCK8和集落形成测定法评估转染的Bel-7404和SK-Hep1细胞的细胞增殖能力。（D）在Bel-7404和SK-Hep1细胞中转染后，使用WB分析p53，Bax，Bcl-2和活化的caspase-3的表达。（E）转染Bel-7404和SK-Hep1细胞后，检测到caspase底物的免疫荧光染色。

3.3 PTPN1和MAP3K11是HCC中miR-125a-5p的直接靶标

使用三个靶点预测数据库预测miR-125a-5p的靶标，确定了131个共同要素（图3A）。结果表明，``JUN激酶活性的激活''是miR-125a-5p的生物学功能，而PTPN1，MAP3K9，MAP3K10和MAP3K11是miRNA的潜在靶标（图3B和3C）。在本研究的其余部分中，重点放在PTPN1和MAP3K11上。

图3.（A）使用三个靶点预测数据库预测miR-125a-5p的靶标；确定了131个共同要素。（B和C）在Cytoscape中用ClueGO和CluePedia分析了这131个靶基因。（D和F）miR-125a-5p及其在PTPN1和MAP3K11的3'-UTR中的假定结合序列。（E和G）miR-125a-5p的过表达被抑制，而敲低则增加了野生型（WT）的荧光素酶活性，但没有突变（MT），PTPN1或MAP3K11 3'-UTR。（H）通过Western印迹评估转染的Bel-7404和SK-Hep1细胞中PTPN1和MAP3K11蛋白的表达。

3.4 PTPN1和MAP3K11上调与肝癌中miR-125a-5p表达负相关

“ JUN激酶活性的激活”与数据库预测的131个常见元件相关的生物学功能之一，这意味着JNK MAPK信号通路可能对miR-125a-5p的生物学功能至关重要。

图4.（A和B）在Starbase的TCGA中PTPN1和MAP3K11被上调。（C和D）PTEP1和MAP3K11的高表达与GEPIA数据库中较差的总体存活率有关。（E和F）qRT-PCR表明，与相邻的正常组织相比，八对匹配的HCC组织中PTPN1和MAP3K11上调。（G–I）qRT-PCR和蛋白质印迹表明PTPN1和MAP3K11在HCC细胞系中上调。 （J和K）Spearman相关分析表明miR-125a-5p表达与PTPN1和MAP3K11表达负相关。

3.5 miR-125a-5p通过HCC中的MAPK信号通路抑制PTPN1和MAP3K11表达

图5. （A）Western印迹表明，miR-125a-5p的过表达减少，而miR-125a-5p的敲低增加，在Bel-7404和SK-Hep1细胞中JNK1 / 2/3和c-Jun的表达。（B和C）Western印迹显示PTPN1和MAP3K11敲低可降低Bel-7404和SK-Hep1细胞中JNK1 / 2/3和c-Jun的表达。

3.6 miR-125a-5p通过MAPK信号通路靶向PTPN1和MAP3K11，从而抑制HCC细胞增殖并诱导其凋亡

图6. （A-D）使用miR-control，miR-125a-5p抑制剂，PTPN1 siRNA 3或MAP3K11 siRNA 1转染Bel-7404和SK-Hep1细胞后，使用CCK8和集落形成测定法评估细胞增殖能力。（E和F）在Bel-7404和SK-Hep1细胞中转染后，检测到裂解的胱天蛋白酶底物的免疫荧光染色。（G和H）使用Western blot检测转染的Bel-7404和SK-Hep1细胞中PTPN1，MAP3K11，JNK1/2/3和c-Jun的表达。

3.7 miR-125a-5p通过体内的MAPK信号通路靶向PTPN1和MAP3K11，从而抑制细胞增殖并诱导凋亡

图7. （A和B）小鼠和异种移植组织的代表性图像。（C和D）异种移植组织体积和重量，miR-125a-5p的过表达被抑制，而miR-125a-5p的敲低促进了肿瘤的生长。（E）在人类蛋白图谱数据库中，HCC肿瘤组织中PTPN1和MAP3K11的表达高于正常肝组织。（F）通过免疫荧光在400x放大倍数下检测到Brdu，Ki67，PTPN1，MAP3K11，JNK1 / 2/3和c-Jun表达。miR-125a-5p的过表达减少了增殖细胞的数量并增加了凋亡细胞的数量，而miR-125a-5p的基因敲除具有相反的作用。

结论

我们的发现表明，miR-125a-5p通过MAPK信号通路直接靶向PTPN1和MAP3K11，从而抑制HCC细胞增殖并诱导细胞凋亡（图8）。因此，单独或组合使用miR-125a-5p模拟物或JNK信号抑制剂可能是治疗HCC的潜在方法。