2019美国癌症研究协会年会(AACR)前瞻 — 过继细胞疗法(ACT)

自从2017年两款CAR-T产品相继上市以来，过继细胞疗法（ACT）持续升温。美国、中国和日本成为该领域的佼佼者。美国癌症研究协会年会（AACR）作为全球规模最大的肿瘤领域学术盛会之一，自然少不了对此研究进展的报导。

今年AACR的ACT研究总共分为四个“section”，收录了共66篇相关摘要。我们摘取了几个主题进行前瞻性分析：3D肿瘤模型在ACT中的应用、NK细胞治疗、CRISPR基因编辑的应用，以及14天T细胞“速成法”。

1.过继细胞疗法（ACT）

过继细胞疗法（adoptive cell therapy, ACT）是指从患者体内分离出具有活性的免疫细胞，在体外进行改造（或不改造）和扩增，重新输入到患者体内以达到治疗疾病（以肿瘤为主）的目的。

人体内免疫细胞种类繁多，每种免疫细胞扮演的角色也各不相同。因此，过继细胞疗法主要包括TIL、LAK、CIK、DC、NK、TCR-T和CAR-T等。

提起细胞疗法，国人的第一印象也许是2016年的“魏则西事件”。事件大致经过：某些医院过度宣传，收取高昂费用，采用未经临床验证的DC-CIK疗法，导致患者“无力回天”。DC-CIK疗法虽然理论上没有问题，而实际上还有很多科学问题尚未解决。这也导致我国细胞疗法的发展一度“沉沦”。然而，“魏则西事件”并未让细胞疗法停滞。

2017年，美国FDA分别批准了诺华的Kymriah和吉利德的Yescarta，标志着ACT的时代真正开启。于此同时，TCR-T和CAR-NK等细胞疗法的发展也是甚嚣尘上。

2018年，诺贝尔生理医学奖更是颁发给两位在免疫治疗方面做出巨大贡献的科学家——安德森癌症中心的James P. Allison和日本的本庶佑教授。

2.ACT中3D肿瘤模型

2019年AACR将于3月29日至4月3日在美国亚特兰大的Georgia World Congress Center举行，届时将有数万人参加。会议的内容更是包罗万象，囊括了实体瘤和血液瘤，基础研究和临床研究，新技术和新药物等等。

众所周知，药物研究在临床前都需要在细胞或者动物上预实验。一般的细胞培养，特别是实体瘤细胞，大部分是贴附于培养瓶的表面形成细胞层，是一种二维结构（2D）。但是这种2D培养和人体内细胞的空间结构完全不一致，很难模拟出细胞处于的微环境。

因此，科学家们开发了3D球型培养（3D spheroids）。相对于2D，3D球型培养的细胞与体内的生理状况更加相似，包括细胞间相互作用、细胞增殖、厌氧状况和基因表达。而且这种模型对应药物筛选也非常有利。

来自德国的Medigene Immunotherapies GmbH公司就开发了这样一种模型，分别构建了肿瘤细胞系和健康原代/多功能干细胞形成的3D球型细胞，用以评价TCR-T细胞在这两种模型中的细胞毒性 [1]。

结果显示：TCR-T能够杀伤和其共培养的球型肿瘤细胞，但对健康细胞形成的细胞球没有影响。这些结果也在2D培养中得到验证。说明3D球型培养是一个有效体外验证TCR-T功能的模型。

另一项来自BioDuro LLC的研究验证了CAR-T在3D模型中的作用。该研究中用荧光标记的Raji细胞（一种淋巴瘤细胞系）来进行3D培养，随后通过不同比例与CAR-T细胞混合培养 [2]。

通过24小时的混合培养，CAR-T能够杀伤与其混合培养的球型细胞，而且与CAR-T细胞数量呈正比。这两项研究同时说明3D球型细胞的培养是TCR-T和CAR-T前期药物测试有潜力的模型。

3.NK细胞疗法

人体免疫细胞里有一群叫自然杀伤细胞（NK），是天然免疫的一道屏障，能够抵御病毒和细菌等外源感染。越来越多的研究也发现NK细胞在杀伤肿瘤细胞中也扮演着重要角色。

今年的AACR有5篇与NK细胞治疗相关的研究，咱们一一讲解。

第一篇来自Celularity，他们从人类胎盘CD34+前体细胞培养出专属异体NK细胞（PNK）。这种细胞在众多实体瘤和血液瘤中展示出细胞毒性，并且在AML动物模型中明显降低肿瘤负荷 [3]。

第二篇关于开发一种长期监测NK细胞ADCC的方法。研究者利用的工具称为Celigo成像系统，不仅能够获得NK细胞杀伤的全景图，而且能更好特化靶标抗体在细胞杀伤功能上的效果 [4]。

第三篇关于体外扩增和工程化NK细胞，通过辐照的K562细胞。被K562刺激的NK细胞不仅提高了激活和生存基因的表达，而且延长了NK细胞寿命并增强了对肿瘤细胞的毒性 [5]。

第四篇关于CAR-NK在转移性葡萄膜黑色素瘤（MUM）中的应用。表达CAR和不表达CAR的NK92细胞都能抑制MUM肿瘤模型生长，但CAR-NK检测在肝脏中聚集，说明有可能解决MUM肝转移的问题 [6]。

最后一篇讲述了NK治疗在小鼠模型上的应用。研究者在体外有条件地扩增小鼠的NK细胞。这种扩增的细胞不仅能减缓乳腺癌肿瘤模型的生长，而且可以延长小鼠的生存率 [7]。

4.ACT中CRISPR的应用

无论是CAR-T、TCR-T还是CAR-NK等细胞疗法，都需要基因工程技术将靶标序列插入相应的载体。CRISPR-Cas9系统的发现，为我们提供了非常精准、廉价、易于使用的基因编辑技术。

CRISPR-Cas9技术在构建CAR-T载体等细胞疗法中得到广泛应用。今年的AACR更是有多达几十项研究应用这项技术。我们选取其中的两篇与细胞治疗相关的摘要，分享给大家。

第一篇用CRISPR-Cas9技术编辑CAR-T细胞，靶向CD33，用以治疗急性髓细胞白血病（AML）。CD33在90%以上的AML患者都有表达。在造血干细胞表面没有表达，在成熟的粒细胞和其他组织也没有表达，因此CD33成为髓系白血病治疗的良好靶点。

该研究开发的异体CAR-T（T细胞来自于患者以外的其他人）。有些患者免疫细胞状态无法达到制作CAR-T的标准，而异体CAR-T的开发可能解决这种问题。但人体对异源免疫细胞的排斥是这种CAR-T应用的一道障碍。

在这项研究中，研究者利用CRISPR-Cas9技术编辑来自健康人的T细胞，将CD33抗体位点插入到TRAC基因座中，该基因的失活能降低移植物抗宿主病（GVHD）。另外，β2-微球蛋白位点也被破坏，防止CAR-T细胞被宿主免疫系统清除 [8]。

研究结果显示：异体抗CD33的CAR-T细胞体外展现出抑制AML细胞系的强劲活性，体内也能抑制AML小鼠模型中肿瘤的生长。

第二篇研究关于应用CRISPR-Cas9技术确定和T细胞衰竭的相关基因。T细胞衰竭是导致T细胞疗法在实体瘤中疗效有限的主要原因之一。利用基因编辑技术可以确定哪些基因在T细胞衰竭中扮演着重要角色 [9]。

5.快速T细胞疗法

虽然T细胞治疗取得了卓越的效果，但对于那些生命垂危的病人来说，时间就是生命。因此，缩短细胞制备时间尤其重要。

凯特公司从提取患者细胞，到CAR-T细胞回输进患者体内，这一过程大约需要18天，诺华的制备时间为22-29天，Juno的制备时间为24天。

来自NexImmune的研究者正在试图解决这一问题，他们的研究结果也会发表在今年的AACR上。他们从T干细胞、中心细胞和效应记忆细胞中分离并产生治疗性的CD8 T细胞，只需要14天时间。

简而言之，研究者利用顺磁性纳米微粒的aAPC，共价结合各种有利于T细胞增殖的抗体。多肽装载这种aAPC，然后在GMP的T细胞扩增平台上生产肿瘤特异的CD8 T细胞 [10]。

AML特异性T细胞可以从非常低频的前体细胞扩增500到5000倍。这个系统用来生产多发性骨髓瘤（MM）特性T细胞也能达到相同的结果。通过细胞因子分析和肿瘤杀伤实验，证实这些T细胞都是具备正常功能的。

而这些细胞最终的功能将会通过临床试验得以验证，通过招募复发/难治性AML和MM患者。如果试验得以成功，这种方法将较大程度上缩短T细胞制备的过程，对急需治疗的患者大有裨益。

参考资料：

[1] Maja Buerdek, Kathrin Mutze, Kai Pinkernell, Dolores J. Schendel. Medigene Immunotherapies GmbH, Martinsried, Germany. 2303 / 2 - In vitro evaluation of TCR efficacy and toxicity using 3D spheroid models.

[2] Ruyi Li, Shanshan Gan, Leixin Zhang, Thomas Broudy, Yong Hu. BioDuro LLC, San Diego, CA. 2314 / 13 - Pharmacology studies of chimeric antigen receptor (CAR) T cells in luminescent xenograft and 3D in vitro tumor models.

[3] James Li, Xuan Guo, Hemlata Rana, Andrea DiFiglia, Joseph Gleason, Uri Herzberg, Robert Hariri, Xiaokui Zhang. Celularity, Warren, NJ. 935 - Genetic modification potentiates the antitumor activity of human placental CD34+ cells-derived NK cells.

[4] Leo L. Chan, Lucas Ferrari De Andrade, Charles A. Thomas, Dmitry Kuksin, Kai Wucherpfennig. Nexcelom Bioscience LLC, Lawrence, MA; Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA; Dana Farber Cancer Institute, Lawrence, MA. 2325 / 24 - Long term time-course monitoring of NK cell-mediated ADCC using the Celigo Image Cytometer.

[5] Mira Tohme, Sasha Lazetic, Kate Jamboretz, Luxuan Buren, Chao Guo, James Trager. Nkarta Therapeutics, South San Francisco, CA. 2304 / 3 - Expanded and engineered NK cells upregulate expression of activation and survival genes associated with increased cytotoxicity and persistence.

[6] Bao Quoc Lam, Takahito Sugase, Mizue Terai, Meggie Danielson, Nadezhda Anikeyeva, Melissa A. Wilson, Yuri Sykulev, Takami Sato. Sidney Kimmel Medical College of Thomas Jefferson University, Philadelphia, PA; Thomas Jefferson University, Philadelphia, PA.

[7] Shih-Wen Huang, Yein-Gei Lai, Jen-Qi Wu, Yae-Huei Liou, Nan-Shih Liao. Academia Sinica, Taipei, Taiwan. 2302 / 1 - Natural killer cell cancer therapy in mouse model.

[8] Brigid McEwan, Zinkal Padalia, Ashley Porras, Jason Sagert, Jonathan A. Terrett, Tony Ho, Demetrios Kalaitzidis. Crispr Therapeutics, Cambridge, MA. 1428 / 9 - Allogeneic CRISPR/Cas9 gene-edited CAR-T cells targeting CD33 show potent preclinical activity against AML cells.

[9] Jin K. Park1, David A. Canner, Rebecca Herbst, Amy Li, Olivia C. Smith, Aviv Regev, Tyler E. Jacks. Koch Institute for Integrative Cancer Research, Cambridge, NY; Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, NY. 1431 / 12 - In vivo CRISPR/Cas9 screen of adoptively transferred T cells reveals novel mediators of T cell exhaustion and immunosuppression.

[10] Sojung Kim, Lauren Suarez, Emily Lu, Celine Walmacq, Daniel Dembrow, Juan Varela, Dan Bednárik, Kenneth Carter, Naimish Pandya, Kristi Jones, Mathias Oelke. NexImmune, Gaithersburg, MD. 1423 / 4 - AIM ACT, a novel nanoparticle-based technology that generates therapeutic numbers of functional tumor-specific CD8+ T cells with T stem cell, central and effector memory phenotype in 14 days.

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