EBV相关的肝内胆管癌的临床病理特征、肿瘤免疫微环境和基因组景观

2021
01/05

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Hannah / VIP说
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近几十年来,ICC的发病率在全球范围内呈上升趋势,其病因和发病机制尚不完全清楚。

肝内胆管癌(Intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC)是第二常见的肝脏恶性肿瘤,与西方相比,东方世界部分地区的发病率要高得多。近几十年来,ICC的发病率在全球范围内呈上升趋势,其病因和发病机制尚不完全清楚。因为其生物侵袭性、较差的可切除性以及目前有限的治疗方法,ICC患者生存率低。目前,大约50%的病例仍然没有任何可识别的危险因素去诊断。

EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)与多种呼吸道/消化道肿瘤有关,特别是未分化鼻咽癌(Undifferentialnasopharyngeal carcinoma,NPC)和EBV相关胃癌(EBVaGC),但EBV感染与ICC发病的关系尚不清楚。

目前关于EBV相关ICC(EBVaICC)的证据水平仅基于病例报告和小本报道。值得注意的是,以前报告的绝大多数EBVaICC病例发生在亚洲,具有中国血统,显示出显著的种族和地理分布特性。到目前为止,对EBVaICC知之甚少,合适的治疗方案仍然未知。因此,需要系统和深入的了解,以进一步阐明这一罕见的实体瘤,并提供对于发病机制和治疗策略有价值的见解。

因此,研究者旨在全面调查中国南方临床病理特征,肿瘤免疫微环境(TIME)和基因组景观。采用EBV原位杂交技术对303例ICCs进行检测,比较EBVaICC与nonEBVaICC的临床病理参数,并采用免疫组化,双重染色,巢式PCR,多重免疫荧光染色,荧光原位杂交和全外显子组测序等方法分析EBV感染情况,肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)和EBVaICC的基因组特征。

并首次报道了一例生存期长达84个月的EBVaICC患者,该患者对包括ICIs在内的综合治疗显示出显著的应答。此外,还首次揭示了来自该肿瘤的EBVaICC和EBV的基因组景观。

Highlights:

EBVaICC占ICCs的6.6%,以EBV潜伏I型和克隆型EBV分离株形式。

EBVaICC具有独特的病因学,临床病理学和分子遗传学特征。

在EBVaICC中,肿瘤浸润淋巴细胞中PD-1和PD-L1以及肿瘤细胞中PD-L1均过表达。

大多数EBVaICC属于TMIT I型,矛盾的是,患者对ICIs可能呈现良好的应答

EBVaICC的LEL亚型与良好的生存率有关,可能与肿瘤浸润的B细胞和CD8+T细胞免疫激活有关。

该研究属于回顾性研究,纳入了303例ICC患者,这些患者于2008年4月至2017年5月期间在中国广州中山大学肿瘤中心进行了首次手术切除。存活患者的中位随访期为50个月。

在原发性ICCs中检测到6.6%(20/303)患者具有EBERs表达,而在其他类型的ICCs中均未观察到EBERs,如肝门周围胆管癌(pCCA),远端胆管癌(dCCA),混合性肝细胞和胆管癌(cHCC-CCA)和肝细胞癌(HCC)。通过双重染色显示仅在EBVaICC肿瘤细胞中检测到EBV,而所有EBVaICCs对EBNA1呈阳性,但对LMP1和EBNA2呈阴性,这表明EBV属于潜伏I型感染。并通过巢式PCR在所有20个EBVaICC中检测出克隆性EBV分离株。

EBVaICC患者年龄24~68岁,中位年龄46.5岁。女性占优势,男女比例为1:3。所有患者均为中国人。10例患者(50%)显示HBsAg血清反应阳性,仅1例患者(5%)有组织学证实的肝硬化。19例(95%)患者存在孤立性肿瘤。根据AJCC TNM分期(第8版),14例(70%)患者分为I/II期,6例(30%)患者分为III/IV期。15例可用病例中有2例(13.3%)血清EBV DNA>1000拷贝/毫升。

EBVaICC的病理资料,包括组织学,免疫组化和原位杂交。组织学上,淋巴上皮瘤样(LEL)亚型和常规型(CT)ICC在EBVaICC中分别占比45%(9/20)和55%(11/20)。在所有LEL亚型EBVaICC的病例中肿瘤内均发现次级淋巴滤泡,但在任何EBVaICC CTs中均未发现次级淋巴滤泡。所有EBVaICC显示胆汁型细胞角蛋白(CK7和CK19)的可变表达,并且显示微卫星不稳定性错义修复蛋白(MLH1,PMS2,MSH2和MSH6)的免疫阳性。

除HBV外,EBV感染与ICC的任何已知危险因素均无显著相关。与nonEBVaICC患者相比,EBVaICC主要发生于女性(75.0%对37.8%),年轻患者(中位年龄46.5对57.0岁),HBsAg阳性率较高(50.0%对26.1%),肝硬化背景较低(5.0%对27.2%),胆石症/胆总管结石率较低(0%对16.8%),孤立肿瘤(95.0%对70.7%)和血清CA19-9水平较低(30.0%对58.0%)(p值均<0.05)。组织学上,ICC的LEL亚型在EBVaICC中显著高于nonEBVaICC(45%对0.7%,P<0.001),表明LEL亚型与EBV感染有密切关系。


尽管EBV感染与ICC中OS和RFS无显著相关,但EBVaICC(LEL亚型)的2年OS率(89%)明显优于EBVaICC(CT)(36%)和nonEBVaICC(38%)(P=0.028)。EBVaICC(LEL亚型)的2年RFS率为67%,高于EBVaICC(CT)和nonEBVaICC的分别为27%和30%(P=0.074),但无显著差异。值得注意的是,EBVaICC的2年OS和RFS率明显优于HBVaICC和LFaICC。

EBVaICC TIL以CD3+T细胞 (84.4%±3.6%),CD20+B细胞 (9.4%±2.8%)和CD68+TAM(6.1%±1.1%)为主。在T细胞群中,CD8+T细胞占71.4%±2.9%,Foxp3+T细胞占15.0%±2.0%,CTLA-4+T细胞占13.6%±1.9%。在EBVaICC中,HLA-DR+M1 TAM(77.6%±2.9%)明显高于CD163+M2 TAMs (22.4%±2.9%)。与nonEBVaICC相比,EBVaICC中CD20+B细胞和CD8+T细胞群体的比例显著增加,而M1/M2 TAMs比例没有发现差异。

与nonEBVaICC相比,EBVaICC中肿瘤浸润免疫细胞的密度显著增加,包括CD20+B细胞,CD3+T细胞,CD68+TAM,CD8+T细胞,FOXP3+T细胞,CTLA-4+T细胞,HLA-DR+M1 TAM和CD163+M2 TAM(所有p值均<0.01)。值得注意的是,EBVaICC的肿瘤免疫微环境明显比HBVaICC和LFaICC更丰富。

与EBVaICC CT和nonEBVaICC比较,EBVaICC LEL亚型具有明显高密度的CD20+B细胞,CD3+T细胞和CD8+T细胞(P均<0.05)。值得注意的是,CD20+B细胞和CD8+T细胞密度的增加分别与ICC中较长的OS和RFS显著相关(所有比较均P<0.05)

EBVaICC中显著过表达PD-L1-TIL,PD-L1-Tumor和PD-1-TIL。95.0%(19/20)EBVaICCs的肿瘤PDL1阳性(IRS评分≥3),而仅22.3%(63/283)nonEBVaICCs 的肿瘤PDL1阳性(IRS评分≥3) (P<0.0001);PDL1-TILs在EBVaICCs中的阳性率为100%(20/20)(IRS评分≥1),而在nonEBVaICCs中的阳性率仅为56.5%(160/283)(P<0.0001)。

共有95.0%(19/20)的EBVaICCs的PD1-TILs阳性(IRS评分≥1),而nonEBVaICCs的PD1-TILs阳性率仅为64.0%(181/283)(P=0.005)。有趣的是,通过FISH分析,95%(19/20)的EBVaICCs中未观察到PD-L1基因扩增。

研究者根据免疫组化将每个ICC样本分为TMIT四种类型(Ⅰ型(PD-L1+/CD8-high),Ⅱ型(PD-L1-/CD8-low),Ⅲ型(PD-L1+/CD8-low)和Ⅳ型(PD-L1-/CD8-high)。结果:Ⅰ型53例(17.5%);Ⅱ型123例(40.6%);Ⅲ型29例(9.6%);Ⅳ型98例(32.3%)。TMIT与ICC中OS显著相关(P=0.014),但对于RFS不显著(P=0.059)。

TMIT I亚组生存获益最好,TMIT III亚组生存获益最差。值得注意的是,EBVaICC与TMIT I显著相关,因为90%(18/20)的EBVaICC属于TMIT I,而nonEBVaICC仅为12.4%(35/283)(P<0.0001)。来自病例4号的患者对包括ICIs治疗在内的联合治疗显示出显著的反应,生存期长至84个月。有趣的是,与HBVaICC和LFaICC相比,EBVaICC具有显著不同的TMIT(除了具有显著升高的TIL和具有高的PD-L1表达之外)。

研究者进一步分析了10个平均复盖率为100×的EBVaICCs的WES数据,鉴定出3353个体细胞同义和非同义突变(包括单核苷酸突变和小插入和缺失,或InDels)。体细胞突变包括1346个非沉默突变和2007个沉默突变,这揭示了高突变率(中位数:每兆酶4.4个突变)。我们发现7个基因是至少在三个患者中受到非沉默突变的影响,包括MUC4,DNAH1,GLI2,LIPE,MYH7,RP11-766F14.2和WDR36。

体细胞突变类型以C:G>T:A和C:G>A:T为主。然后,鉴定出三个独立且稳定的突变标记。另外,用MuSigCV软件预测了22个潜在的EBVaICC的驱动基因。值得注意的是,EBVaICC显示出与其它EBV相关癌包括EBVaGC,NPC和肺淋巴上皮瘤样癌(LELC)和其它感染相关CCA(包括HBVaICC和LFaCCA不同的突变模式。

当分析具有从药物基因相互作用数据库汇编的信息的Maftools中的可用药基因组的突变时,在三个病例(30%)中鉴定出PRSS1的缺失,PRSS1被认为是胰腺炎中的疾病原因。CD274的扩增与EBVAGC中PD-L1的表达增高有关,而CD274的扩增与EBVaGC中PD-L1的表达增高有关。用novoBreak算法检测10例EBVaICC中用分离双色探针进行FISH分析未发现FGFR2基因融合。

在ICC衍生的EBV中发现的前40个常见非同义突变。所有病例均有BKRF4(H171N),BcRF1(T33A),BKRF4(G169V),BOLF1(D1154E)和BPLF1(S405G)等新的热点,除BPLF1(S405G)因GC DNA模板过高而导致突变验证失败外,其余的热点均在肿瘤组织中被成功验证。

值得注意的是,BOLF1和BRRF2的变异在ICC中显著富集,而在EBNAs,LMP1,LMP2和BDLF2/3上的变异除外,这些变异在来源于其它癌症的EBV中一致报道。

然而,这项研究在某些方面是有限的。虽然纳入了大量的ICC队列,但EBVaICC和对照组(pCCA,dCCA和cHCC-CCA)的数量仍然较少,部分结果可能需要验证。

此外,由于新鲜组织标本中RNA质量较差,整个转录组测序失败。此外,根据我们的WES数据,没有观察到EBV基因组整合的可靠证据。未进行全基因组测序,EBV是否直接整合到宿主基因组中仍是未知的。

EBVaICC占ICCs的6.6%,以EBV潜伏I型和克隆性EBV分离株形式。EBVaICC的独特临床病理特征如下:女性多见及年轻患者多见,孤立性肿瘤,具有较高HBV感染率,少有肝硬化背景,增高的淋巴上皮瘤样(LEL)亚型比例。

EBVaICC的肿瘤免疫微环境比nonEBVaICC更丰富。EBVaICC LEL亚型中CD20+B细胞和CD8+T细胞密度和比例明显增高,与EBVaICC常规型和nonEBVaICC相比,LEL亚型与2年OS和RFS显著相关。TIL中PD-1和PD-L1及肿瘤细胞中PD-L1在EBVaICC中均过表达。肿瘤环境免疫类型I型(TMIT) (PD-L1-Tumor+/CD8-high)在EBVaICC中明显高于nonEBVaICC。在至少三个病例中发现了突变基因,包括MUC4,DNAH1,GLI2,LIPE,MYH7,RP11-766F14.2和WDR36。EBVaICC与已报道的肝吸虫相关胆管癌和HBVaICC相比具有不同的突变模式。

结论:ICC的亚分类EBVaICC具有独特的病理学特征、临床病理学特征和显著增加的肿瘤免疫微环境的分子遗传学特征。大多数病例属于TMIT I型。但自相矛盾的是,EBVaICC患者可能是免疫治疗的候选者。

参考文献

图片

  1.   J Hepatol . 2020 Nov 16;S0168-8278(20)33763-6

  2. 本文来自VIP说,作者Hannah。

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关键词:
肝内胆管癌,EBV,免疫微环境

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