人人都能学懂CAR-T（一）｜CAR的前世今生

利用免疫学治疗手段来攻克肿瘤，一直是免疫学在转化医学方面应用的重要方向。随着各种组学(基因组学，蛋白组学等)的发展，肿瘤细胞由于突变产生的免疫原性得到了广泛的认可，这为肿瘤免疫治疗奠定了理论的基础。

同时，随着肿瘤免疫学研究自身的积累，肿瘤免疫治疗近期取得了巨大的进步，一系列新的免疫治疗手段逐步进入临床，其中以嵌合抗原受体T细胞（CAR-T细胞）治疗为代表的肿瘤细胞免疫疗法在白血病等血液系统恶性肿瘤的治疗中，取得了很大的进步。然而，CAR-T细胞究竟是何方神圣？CAR本身又有何含义呢？

CAR-T细胞起源于过继细胞转移，实现于转基因技术

嵌合抗原受体——CAR是一种基因工程技术制造的人工受体分子，它可以赋予免疫效应细胞（如T淋巴细胞）针对某个靶点抗原表位的特异性，从而增强T淋巴细胞识别抗原信号与活化的功能[1]。CAR-T细胞疗法本质上是一种过继细胞转移（ACT），ACT是最早被提出是在器官移植过程中，供体的淋巴细胞被输入受体体内的过程，该过程抗原介导移植器官排斥反应的发生，后逐渐发展为治疗恶性肿瘤的疗法[2]。

1989年，著名科学家Gross G 、Waks T和Eshhar Z在一项研究中，将表达特定抗体的基因序列赋予细胞毒性T细胞（CTL），该抗体赋予T细胞识别半抗原——2,4,6-三硝基苯基（TNP）的能力，这使得T细胞实现了抗原特异性的、非MHC限制的活化及其效应的增强。这三位科学家认为：“赋予T细胞一个嵌合的抗原受体，将是未来人类对抗肿瘤的一种重要途径。”这便是人类历史上，首次提出CAR这一概念。

20世纪90年代，随着转基因技术的出现，使得人们可以自由编码基因组（如改造TCR或人工合成CAR），并对编码的基因进行转染，从而改变T淋巴细胞识别抗原的特异性。由此，过继细胞疗法开启了新的篇章。

CAR的发展史

 2008年，Fred Hutchison肿瘤研究所等机构首次使用CAR-T细胞对B细胞淋巴瘤来进行治疗，虽然治疗结果不太理想，但这一临床实验的关键在于证实了以表达CD20的B细胞作为靶点的CAR-T细胞治疗是相对安全的。

随后，在2010年NCI杂志报道了一例B细胞淋巴瘤治疗成功的病例，利用针对CD19的CAR-T，患者的淋巴瘤得到控制，然而，人体内正常B细胞也被清除，血清免疫球蛋白也显著降低，但值得庆幸的是，人体在一段时间内可耐受B淋巴细胞的耗竭，这一报道也为CAR-T细胞治疗B细胞来源的淋巴瘤的有效性提供了理论和实际的支持。

在2011年，美国宾夕法尼亚大学的Carl June教授领导的团队将特异性识别CD19的CAR-T细胞用于B细胞来源的慢性淋巴细胞白血病的治疗，显示了“治愈”的疗效，随后在复发难治性急性淋巴细胞白血病展开临床实验，也取得了良好的疗效。由于这一突破性的进展以及其他免疫调控手段的发展，Science杂志将肿瘤免疫治疗评为了2013年科技突破进展的第一名。由此，CAR-T细胞研发的成功在世界各国引起了广泛的影响，各国开始大量开展基于CAR-T细胞的科学研究和肿瘤治疗的临床试验。

图1: CAR的发展简史

历代CAR结构进化历程

经过近三十年的发展，迄今为止，根据CAR的不同， 可以将CAR-T 细胞分为无共刺激信号CAR-T 细胞（ 第1 代）、单一共刺激信号CAR-T细胞（第2 代）、双/多共刺激信号CAR-T 细胞（第3 代）和精准CAR-T 细胞（第4 代）等4 个发展阶段。这4 代CAR-T 细胞的胞外识别区都是抗体的V 区或其衍生片段（ 如单链抗体V 区片段，ScFV等等），跨膜区也并无很大区别，所以一般以CAR的胞内段结构进行它们的阶段划分。

图2: CAR结构[3]

1、第一代CAR

第一代CAR-T细胞的胞内段结构相对简单，主要是由CD3分子ζ链的ITAM区所组成的[1]。第一代CAR-T细胞胞内段缺乏T细胞活化所必须的第二信号，即共刺激信号，因此第一代CAR-T细胞必须与抗原提呈细胞表面共刺激分子配体相互作用，从而获得天然的共刺激信号，这使得其被激活效率较低，所以并未在临床应用中获得预期的疗效。

2、第二代CAR

第二代CAR-T细胞在第一代CAR-T细胞的基础上，在胞内段添加了一个来自共刺激分子CD28或者CD137（4-1BB）的ITAM区，胞外的抗原识别区与靶抗原结合后，可使T细胞同时获得抗体刺激信号及共刺激信号[4]。这使得第二代CAR-T细胞的活化能力远远强于第一代，同时也在临床治疗中展现了令人惊喜的治疗效果。一般认为，CD28所传递的活化信号，相较于CD137更强，可使T细胞在较短时间内达到很高的杀伤活性；而CD137所传递的活化信号则会维持的更加持久。由于第二代CAR-T细胞使用的转染病毒载体多为逆转录病毒，可容纳及携带的基因片段有限，难以将CD28和CD137这两个共刺激信号分子的ITAM区同时转染入T淋巴细胞内，因此人们不得不在获得CAR-T细胞更强的激活强度与活化持久度中进行选择。

3、第三代CAR

第三代CAR-T细胞的主要结构与第二代CAR-T细胞大同小异，但第三代CAR-T细胞使用了慢病毒作为转染载体，可携带更大的基因片段进入T淋巴细胞，因此，它的CAR胞内段常常可以含有2个或者更多的共刺激信号ITAM区[5]。理论上，第三代CAR-T细胞相较于第二代CAR-T细胞应该更具活化及杀伤能力，然而有的研究表明，第三代CAR-T细胞杀伤活性并没有获得明显的提升[6]。因此，简单的添加共刺激分子ITAM区，并不一定能给CAR-T细胞疗法带来更好的疗效，这也许是因为一个共刺激分子的ITAM在T淋巴细胞内产生的活化信号就已经达到T淋巴细胞活化信号的阈值，单纯在数量上添加ITAM区不会再进一步提升CAR对T淋巴细胞的活化效果。

4、第四代CAR

第四代CAR-T细胞，也称为精准CAR-T细胞。这一代CAR-T细胞的设计主要从肿瘤等疾病的精准治疗角度考虑。目前，已知CAR-T细胞可在患者体内存活长达10年以上，长期生存有利于CAR-T细胞在体内监视肿瘤细胞，防止肿瘤复发；但另一方面，CAR-T细胞在清除完肿瘤细胞后，也可因识别正常细胞表面的肿瘤相关抗原而攻击体内正常的细胞。CAR-T细胞所带来的这种毒性反应，不同于其他的免疫疗法，这更倾向于是一种“on-target”（中靶）反应。因此，这种毒性反应是可逆的，在CAR-T细胞被消耗完后，这种不良反应也就随之消失。所以，有学者在CAR的结构中添加了自杀基因或者可控性自杀基因（例如某些药物敏感基因），从而实现对CAR-T细胞在体内存活时限的可控[7]。目前CAR-T细胞主要用于治疗血液系统肿瘤，在实体瘤的治疗中还未见显著的成效，这主要是因为CAR-T细胞常常无法进入肿瘤内部。因此，有学者在CAR的设计中添加了细胞因子或者趋化因子的受体结构，从而增加T淋巴细胞在肿瘤组织中的浸润，从而达到增强杀伤实体瘤的效果，这也是第四代CAR-T细胞的常用设计思路之一[8]。

图3:各代CAR-T发展历程[9]

CAR-T细胞疗法或能终结癌症

目前，CAR-T 细胞已经被广泛应用于各种肿瘤的细胞免疫治疗中。据统计，包括美国FDA在内的多个国家药监部门已经批准了多达300 个以上的CAR-T 细胞治疗临床实验的项目，同时，也有部分CAR-T细胞已上市生产。

表1: 市场主要CAR-T细胞产品

来自这些临床实验治疗项目的统计数据表明，虽然由于使用了不同的CAR和T细胞来源与制备工艺，以及预处理和联合用药的差异，导致各个临床项目的效果存在一定差异， 但总体显示，CAR-T细胞治疗肿瘤是有效的，其有效率为30％~70%，甚至可以高达90%以上。例如，FDA 已经批准上市的诺华CTL019 治疗非何杰金淋巴瘤的完全缓解率竟然达到了令人惊讶的93%。也许，CAR-T 细胞治疗将彻底终结人类因肿瘤丧生的宿命。

参考文献：

1. Sadelain, M., R. Brentjens, and I. Riviere, The promise and potential pitfalls of chimeric antigen receptors. Curr Opin Immunol, 2009. 21(2): p. 215-23.

2. Mitchison, N.A., Studies on the immunological response to foreign tumor transplants in the mouse. I. The role of lymph node cells in conferring immunity by adoptive transfer. The Journal of experimental medicine, 1955. 102(2): p. 157-177.

3. Gill, S., M.V. Maus, and D.L. Porter, Chimeric antigen receptor T cell therapy: 25years in the making. Blood Reviews, 2016. 30(3): p. 157-167.

4. Maher, J., et al., Human T-lymphocyte cytotoxicity and proliferation directed by a single chimeric TCRζ/CD28 receptor. Nature Biotechnology, 2002. 20(1): p. 70-75.

5. Morgan, R.A., et al., Case report of a serious adverse event following the administration of t cells transduced with a chimeric antigen receptor recognizing ERBB2. Molecular Therapy, 2010. 18(4): p. 843-851.

6. Ramello, M.C., et al., An immunoproteomic approach to characterize the CAR interactome and signalosome. Sci Signal, 2019. 12(568).

7. Chmielewski, M. and H. Abken, TRUCKs: the fourth generation of CARs. Expert Opin Biol Ther, 2015. 15(8): p. 1145-54.

8. Kagoya, Y., et al., A novel chimeric antigen receptor containing a JAK-STAT signaling domain mediates superior antitumor effects. Nat Med, 2018. 24(3): p. 352-359.

9. Abreu, T.R., et al., Current challenges and emerging opportunities of CAR-T cell therapies. Journal of Controlled Release, 2020. 319: p. 246-261.