厉害!LED照一照 “基因剪刀”就能指哪剪哪

2020
07/21

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张佳星 / 科技日报
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现在,我国科学家终于为“基因剪刀”创建了可行的光控开关

通过感光元器件实现对事物的控制,“光控”在现实生活中已慢慢普及,例如手机人脸识别解锁、汽车雾灯自动开启……这次被光操控的是基因编辑。我国科学家的这一研究成果近日发表在《科学·进展》杂志上。

“LED发出的730nm(纳米)的远红光可激活系统进行基因编辑工作。”论文通讯作者、华东师范大学生命科学学院、医学合成生物学研究中心研究员叶海峰对科技日报记者表示,只有在光照到的地方,基因的“编辑”“剪切”才会发生,从而真正做到指哪剪哪。

创建关键元件为基因编辑装上自动开关

CRISPR-Cas9基因编辑技术近年来应用广泛,被形象地称为“基因剪刀”,使得人类掌握了简便可行的基因“操控术”。

然而,要更便捷地操控基因编辑,需要一个“便捷按钮”,让人们按一下就能启动,再按一下就能关闭,推动其走进“自动化时代”。尤其当基因编辑要走进临床应用,必须要具有灵活、高精度的操控方法,才能使其更具安全性。

“实现光控”需要在基因编辑前装一个“光感装置”用于“引爆”,这个装置长什么样子?有哪些零件?

在红细菌中有一种蛋白BphS,它在接收到远红光的信号后会被激活,释放一个信号。而在放线菌里的蛋白BldD,接收到这个信号后能与DNA序列结合。

“我看到这个信息的时候,觉得非常兴奋。前一种蛋白让光和生物体‘接上头’,后一种蛋白又‘链接’上了DNA。”叶海峰说,这种“跨界打通”意味着有很多工作可做,因为只要信号能传导到DNA,就能推进生物学的操控。

叶海峰团队以放线菌中的BldD蛋白为基础,将其亲和DNA序列与哺乳动物的转录激活子融合,创制了一个杂交型的转录激活子,这一开关成为按下基因编辑“启动键”的关键元件。

这一元件的前方设置了光敏蛋白,接收光信号;后方连接上“基因剪刀”Cas9核酸酶。这个巧妙的设计使得整个系统只有感光后,才能够启动基因编辑。光控基因编辑的“图纸”就此设计完成。

验证上百种序列拼出远红光操控的编辑系统

理论“图纸”和关键元器件都已准备就绪,叶海峰团队开始用合成生物学的方法对这些关键元器件进行组装。

令人意想不到的是,在细胞水平的验证中,基因编辑并没有因为光的有无而产生明显的变化,远红光照射没能刺激Cas9核酸酶的高量表达,熄灭光源也没有阻止基因编辑工作。

问题出在了哪里?按照“图纸”设计,整个流程应该是无懈可击的。

叶海峰百思不得其解。“这一研究工作我们持续推进了5年,有的关键性问题如果不能解决将会耽误整个研究的进展。”叶海峰说,合成生物学要在活体内运转,会有很多无法排查的意外。它不像编程,跑一遍会有纠错,或者至少会提示哪个部分出现“BUG”。

这次的“BUG”出现在哪里?启动基因的工作被相继验证。2017年、2018年,叶海峰课题组在《科学·转化医学》《美国科学院院刊》相继发表论文,证明了远红光调控转基因表达控制系统的可行性以及基因编辑CRISPR-dCas9酶的转录激活都是可行的。

“我们试验了各种方案,但整个系统的运行却都失败了。”叶海峰说,这个结果意味着需要对策略进行根本性的调整。

图源:图虫创意

直到有一天,叶海峰在《自然·生物技术》上看到一篇张锋(基因编辑技术发明人之一)的文章,上面说基因编辑的Cas9核酸酶可以一拆为二,拆开来之后的两半再合起来也是有功能的。

“受到这样的启发,我们就想可不可以把它拆成两半,一半是连续的强表达(自始至终一直表达),另一半用光驱动调控来表达。”叶海峰说,就像“钥匙”的两半拼在一起才能开锁一样。

“拼”这个动作又要怎么自动实现呢?叶海峰想到了热纤维梭菌中的一对能够自发相互结合的蛋白Coh2和DocS。让它们加入进来,分别与Cas9的两部分融合,Coh2和DocS就会像“磁石”一样,将Cas9的两部分拼装成完整、有功能的Cas9核酸酶。

“究竟是哪一半用光来调控诱导表达,都是有说法的。”叶海峰回忆,课题组对多种情况进行了试验,至少进行了上百种不同序列的验证,以寻找最佳光控基因编辑效果。

“我们还对整个系统进行了优化,例如质粒的浓度配比,核输入信号和核输出信号的选择及组合等,并在细胞水平进行了测试。”叶海峰说,经过严谨的优化,实验结果最终令人满意,并将其命名为“FAST系统”。

研究结果显示,FAST系统在LED发射的低强度远红光照射下可以诱导细胞内的基因编辑,而在黑暗情况下保持“静默”的效果也很好。

进一步研究表明,FAST系统在多种细胞中均显示出可调控的基因编辑效果,并具有很好的光照强度和时间依赖性,以及高度的时空特异性,为研究FAST系统在动物体内的可调控基因编辑能力奠定了基础。

“我们至今也不太清楚为什么直接调控表达完整Cas9核酸酶的系统不成功。”叶海峰说,不按程序走,这就是生命科学的神奇之处,而合成生物学正是在破解这些意外中积累起来,最终解决更大的科学命题。

光照时间太长活体高效递送还需“打怪升级”

生命体是复杂的,在细胞水平运转良好的系统在活体中能不能工作,仍面临着重重挑战。为此,在进行了细胞验证后,研究团队还进行了转基因报告模型小鼠和肿瘤模型小鼠的验证工作。

“让整个系统在活体中工作,会遇到新的问题,比如递送的问题。”叶海峰解释,FAST系统由好几个质粒组成,它们进入细胞比较简单,但能不能突破重重阻碍进入到组织细胞里面呢?比如高效递送到肝脏和肿瘤组织里面,就需要借助于递送系统,而且递送的效率直接决定整个系统的工作效率。

“研究推进时,递送技术是又一个难题,我们最初直接通过静脉注射,效果却不是那么好。”叶海峰说,“细胞中工作的质粒在进入活体的时候受到了阻碍,因为整个系统承载的元件太多,所有元件同时递送的效率不能保证,且质粒会被机体认为是外来物而被清除掉。”

想进入活体,整个系统还需要再调整。“这就好比原来坐的卡车太大了、目标明显,需要换乘一个‘特洛伊木马’潜进去。”叶海峰说。

研究团队后来在合作团队的帮助下,使用另一种更小的、能够整合进细胞里的质粒进行递送工作。实验结果中,转基因小鼠在肝脏部位显示出了基因编辑的报告情况,表明小鼠肝脏细胞中DNA可通过光控编辑。

实体瘤是比组织器官更致密的组织,进入其中则需要进一步升级递送系统。

“为了把FAST系统高效递送到肿瘤组织细胞里面,我们与浙江大学专门制作DNA分子递送的团队合作,用纳米技术合成的材料实现了向肿瘤组织的高效递送。”叶海峰说。

在肿瘤小鼠模型中的验证结果显示,将FAST系统递送至小鼠体内的肿瘤后,通过远红光LED的照射,FAST系统能切割肿瘤致癌基因,从而显著抑制肿瘤的生长。

再好的技术只有走进应用才能实现价值。“之所以希望实现光控,初心就是希望推进广泛的应用。”叶海峰说,实验也证明了远红光可以透过小鼠的皮肤进入到小鼠的肝脏内部,甚至进入到实体瘤内部。这意味着FAST系统有疾病治疗的应用潜力。

叶海峰表示,团队仍在进一步优化光控基因表达系统,例如现在的光控系统需要光照2小时才能工作,而未来希望得到改进后,照射几秒就能产生效果。

本文转载自科技日报,作者张佳星。

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关键词:
肿瘤,光控,基因编辑,红光照射

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