解读Sc Adv︱生物工程技术再现阿尔兹海默症3D人脑组织模型

2020
05/20

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LTNeurosci / 逻辑神经科学
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阿尔茨海默症(AD)是一种进行性神经退行性疾病,可导致严重的认知能力下降、短期记忆丧失、言语能力受损、最终导致日常活动功能的丧失。

阿尔茨海默症(AD)是一种进行性神经退行性疾病,可导致严重的认知能力下降、短期记忆丧失、言语能力受损、最终导致日常活动功能的丧失[1]。早发性AD发病年龄一般为60岁,甚至更年轻,且仅约占总AD案例的1- 6%,其中大部分属于家族性早发AD[2]。而散发性或迟发性AD约占总AD案例的95%,且病因十分复杂。

大脑神经纤维缠结(NFTs)和毒性老年斑是AD的两个标志性特征。NFTs由微管相关蛋白Tau的异常过度磷酸化和错误折叠所导致,老年斑则由胞外β-淀粉样蛋白(Aβ)肽的聚集而成[3]。除此之外,AD的特征还包括细胞死亡、神经胶质的过度激活、神经炎症、突触功能障碍以及神经网络的破坏等[4-5]。

尽管,这些特征很好地提示了AD的医学诊断和治疗价值,然而,遗憾的是,AD的具体病因仍未被精准定义。

有趣的是,有研究表明,实际上Aβ1-42单体具有神经保护作用,通过对抗营养剥夺和兴奋性中毒死亡,从而维持了持神经元的存活[6]。而单体的聚集物则具有神经毒性,即单体形成低聚物,原纤维,最终形成老年斑,并最终与AD的神经毒性相关[7]。

越来越多的证据表明,病原体参与了散发性AD的进展[8-9]。AD病原体假说认为,不同的病原体可以作为触发器,诱导和(或)导致Aβ1-42单体的积累[10]。有许多病原体,如肺炎衣原体、伯氏疏螺旋体和玻璃假丝酵母菌等,能够逃避宿主的免疫反应,并渗入大脑,从而形成潜在的慢性感染;在一些免疫缺陷和(或)老年个体中,这一危险则更容易发生[11]。此外,这些病原体也会进一步诱导反应性神经胶质增生和促炎反应,并最终导致进行性神经退行性变和痴呆[12]。

单纯疱疹病毒(HSV)是人类最常见的病原体,有两种亚型(I和II型),且两种亚型有较大区别。其中,I型HSV(即HSV-1)是一种嗜神经型的双链DNA病毒,通常潜伏于周围神经系统。有研究表明,HSV-1可能是散发型AD发病的致病因子[9、13]。HSV-1具有穿透血脑屏障的能力,因为其会引起单纯疱疹病毒性脑炎[14]。而且,HSV-1的再激活可以是无症状的[14]。此外,也学者在散发性AD患者死后脑组织的淀粉样斑块中检测到了高水平的疱疹病毒科DNA[15]。

美国塔夫斯大学的工程学教授David L. Kaplan,长期专注于应用生物高分子工程,解析结构-功能的关系,重点研究自我组装,生物材料工程以及再生医学。在此,鉴于HSV-1在AD进展中的这种潜在因果关系,David Kaplan课题组的一个研究目标便是开发出一种疱疹病毒诱导AD的三维(3D)人类大脑模型,从而帮助揭示HSV-1在AD进展中的机制。相关成果已于2020年5月6日以A 3D human brain–like tissue model of herpes-induced Alzheimer’s disease 在线发表于Science Advances。

论文首页截图

正式研究开始前,作者不得不面对一个大困难,即如何在体外建立散发性AD的人体模型?因为散发性AD的病因复杂且不明确,自然疾病进展缓慢,因此,精准地建立体外模型具有很大挑战。

那么,作者提出的整体研究思路是:通过生成健康且与生理相关的3D人体组织模型,并结合人诱导神经干细胞(简称hiNSC)和HSV-1技术,进而来研究散发性AD。

具体地,首先,作者从人包皮成纤维细胞进一步获得了健康且可快速分化的hiNSC系[16],并确定了hiNSCs能够被HSV-1所感染,即具有很好的感染复数(简称MOI,指在一个实验体系中感染病毒的细胞数和总细胞数之比)(图1A-B),并且,低水平病毒接种会随着时间的推移导致高水平的感染(图1A、C)。这或许暗示了患者中HSV-1感染的慢性再激活。进一步地,研究发现,高水平的HSV-1感染会导致细胞死亡(图1D-E),而低水平的感染则导致了hiNSCs严重的形态变化,即形成大的多细胞结构,并存在于神经突的延伸(图1F-H)。

图1 hiNSCs对HSV-1感染具有高度敏感性

(图片引自:Cairns et al., Sci. Adv. 2020; 6 : eaay8828)

紧接着,作者探究了这种特殊的多细胞结构(图2A)(ThT即硫黄蛋白T,是一种苯并噻唑类染料,与淀粉样蛋白原纤维结合后表现出强荧光,因此能够很好的识别这些特殊结构);这些特殊细胞结构中含有高水平的Aβ1-42(非Aβ1-40)(图2B-C、H);qPCR结果也显示,HSV-I感染致使APP和BACE1的明显下调,以及PSEN1/2的明显上调(图B-C);而且免疫组化染色也发现了磷酸化的tau(Ser202/Thr205)(图2I)。这些结果则说明HSV-I感染的hiNSCs具有与AD很相似的特征,即NFTs和老年斑。

图2 HSV感染导致了Aβ阳性的似老年斑块形成、以及hiNSCs中AD特异性调节基因的改变

(图片引自:Cairns et al., Sci. Adv. 2020; 6 : eaay8828)

与此同时,作者检测到了其他标志物,比如,神经胶质原纤维酸性蛋白(简称GFAP),GFAP阳性的细胞呈肿胀、球状形态,且类似于肥胖型星形胶质细胞(图3A-B);其他激活性星形胶质细胞(图3C-E)和神经炎症标记物(图3F-G)也明显的升高。这部分结果则提示:经HSV-1感染的hiNSCs也具有其他AD特征,包括神经胶质的过度激活、及神经炎症。

以上结果综合表明,hiNSCs能够被HSV-1感染,且感染后的hiNSCs具有很多与AD类似的特征。那么,有没有某种机制可以阻止或消除病毒,从而缓解或改善这些AD表型?

图3 HSV-1引起了hiNSCs中的反应性神经胶质增生和神经炎症(激活性星形胶质细胞标记物:波形蛋白(vimentin)、脂钙蛋白2(Lipocalin2,简称LCN2)、丝氨酸蛋白酶抑制剂3(Serpina3,简称SERP3);神经炎症标记物:肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor α,简称TNFα)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,简称IL-1β)、IL-6、干扰素γ(interferon,简称IFNγ)

(图片引自:Cairns et al., Sci. Adv. 2020; 6 : eaay8828)

伐昔洛韦(Valacyclovir)是鸟嘌呤类似物类抗病毒药物,它是阿昔洛韦(Acyclovir)的前体药物,即阿昔洛韦与缬氨酸形成酯的盐酸盐,在体内可转化为阿昔洛韦。在病毒感染细胞内,阿昔洛韦被脱氧苷激酶活化,进一步磷酸化为三磷酸脂,通过抑制DNA聚合酶,并在DNA聚合酶作用下,与延长的DNA链结合,终止病毒的复制,从而达到抗病毒作用。伐昔洛韦对带状疱疹病毒、单纯疱疹病毒(即HSV)、EB病毒、巨细胞病毒、以及病毒性脑膜炎等有较强的治疗效果(本部分内容参考自网络)。

伐昔洛韦的分子结构

(图片引自:https://en.wikipedia.org/wiki/Valaciclovir)

因此,当研究者用一定剂量(为200μM)的伐昔洛韦(简称VCV)处理病毒感染细胞时,发现,VCV可显著降低HSV-1感染。图4A为确定HSV-1感染率和似老年斑块生成率的差异。图4B-C分别为免疫染色和qPCR结果;格外地,当同时VCV处理和HSV-1感染细胞(即图4 D0,D1为病毒感染24h后再用VCV处理)时,病毒感染几乎能被阻止(图4A-C)。VCV处理也能显著减少似老年斑块的数量和大小(图4F-I),VCV处理D0时,AD标记基因APP,BACE1,PSEN1,PSEN2能够回归到对照组水平。而且VCV处理对HSV-1致使的神经胶质增生和神经炎症也有类似的缓解效果(图4J-K)。同时,值得我们警惕的是,即使hiNSCs没有被HSV-1所感染,HSV-1的分泌因子也能导致反应性胶质细胞数量的增多,即星形胶质细胞增生。

图4  VCVc处理可导致hiNSCs中由HSV-1感染导致的AD样表型的减少

(图片引自:Cairns et al., Sci. Adv. 2020; 6 : eaay8828)

以上所有(即前部分实验)的结果提示我们:初始的低剂量的HSV-1感染足以引发一系列的神经退行性事件,并且这些事件与最初感染无关,因为某些HSV-1分泌因子也能够导致特定的神经退行性事件。因此,鉴于这些证据性的发现,作者想进一步(即后部分实验)建立一个体外模型,即疱疹病毒诱导AD的3D人脑组织模型(图5A)。

简单来讲,首先制得了一种高为2mm、外径为6mm、内径为2mm的蚕丝多孔层粘连蛋白包被的支架,然后在孔里种植一定密度的hiNSCs,并过夜贴附,再然后用I型胶原蛋白在培养条件下固定4周,最后,在HSV-1感染(MOI为0.0001) 或对照处理1周后,再进行实验分析(图5A)[16-17]。

接下来,作者用染色了泛神经元(pan-neuron)的标记物β-III微管蛋白(简称TUJ1),以观察3D模型中大脑样组织的生长情况。病毒感染1周后,神经元出现了局部的缺失(图5B);实验也确定了病毒对3D模型也有很好的穿透能力,即病毒3D大脑样组织(细胞)也有一定的感染能力(图5C)。而且,感染HSV-1的3D模型中,作者观察到存在十分明显的Aβ阳性的似老年斑,以及与前实验现象一致的细胞形态的变化(图5D,图3A-B)。

图5 3D大脑模型中的hiNSCs可在初始低水平HSV-1感染时产生类AD表型

(图片引自:Cairns et al., Sci. Adv. 2020; 6 : eaay8828)

此外,在3D模型中,也检测到了与前部分实验相似的AD标记基因的变化:APP和BACE1均显著下调,而PSEN1与PSEN2则显著上调(图5E-H);以及与前部分结果类似的激活性神经胶质增生和神经炎症(图5I-J)。而且,在HSV-1感染的3D模型中,qPCR结果显示了有40多个与AD相关的上调基因。那么,这几部分结果则充分表明:此3D人脑组织模型能够很好地模拟(或再现)前部分实验的现象和结果,即3D大脑模型中的hiNSCs也能够响应初始低水平HSV-1的感染,从而出现一些类似于AD的特征。

文章最后,作者人认为,任何生物工程组织模型必须具有一定的生物功能,方能很好地体现其生物学意义。于是,作者想知道这种3D模型是否能够产生并维持电生理活动。

高水平的Aβ寡聚物能够导致突触功能障碍和电位的长期降低,而且这与记忆丧失相关[18]。因此,作者认为,疱疹病毒诱导AD的3D人脑组织模型也能够再现与患者有关大脑活动减少的症状。

局部场电位是一种电生理记录,由位于一小块神经组织内的常驻神经元的总电流所产生,这个区域的电压是由突触活动产生的,因此可被测量和量化[19]。于是作者在3D模型上安置了一个微电极来读取该区域随时间的电压变化,进而表明模型组织中是否存在活跃的放电神经元,从而体现模型是否有一定的生物学功能(图5L-M)。结果显示了HSV-1感染的的模型组织有明显的电生理减少的现象(图5N-O)。这部分证据则说明:3D人脑组织模型不仅能够很好再现AD表型,而且还具有一定的AD生物学功能,即能够指示AD患者的大脑功能受损,进而暗示了AD患者的记忆丧失。

总的来说,这项研究中,学者首次报道了3D人脑模型中呈现出由疱疹病毒引起的AD的直接因果关系。模型能够很好地模拟生理人类疾病的许多方面,包括Aβ斑块形成、神经纤维缠结、反应性胶质增生、神经炎症、神经元丢失和神经网络功能减弱等。该模型也在短时间内展示了快速、健康和生理相关的表型。

这一生物工程技术将为进一步阐明HSV-1介导的散发性AD发病机制、以及确定潜在疾病治疗靶点提供了重要见解。

原文链接:

https://advances.sciencemag.org/content/6/19/eaay8828

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关键词:
生物工程技术,阿尔兹海默症,3D人脑组织模型

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