重磅:家猪死后数小时脑循环和细胞功能的恢复

2020
04/26

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刘飞 / 急诊医学资讯
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研究猪死后数小时后,其大脑中的神经细胞和血管内皮细胞是否存在正常功能,并且神经系统的功能在不同的指标上与正常的猪相比存在怎么样的差异。



1、目的

研究猪死后数小时后,其大脑中的神经细胞和血管内皮细胞是否存在正常功能,并且神经系统的功能在不同的指标上与正常的猪相比存在怎么样的差异。

2、方法

动物手术操作:采用6-8个月大,50–75 kg家猪进行实验。将家猪电击击晕,然后根据美国农业部的规定放血杀死。然后将这些家猪在颈3椎骨处断头,并且进行实验动物的实验前处理准备,所有这些步骤都在室温下的冰面上进行。家猪的头部血管紧留下颈内动脉,大部分颅骨切除,以利于进行观察及检测。

BEx灌注技术及BEx灌注液:作者们设计了一种特殊的灌注设备,这个设备的特点在于可以模拟不同心率的血流动力学参数,并且在此同时维持实验家猪的大脑组织其他部分保持稳定。

对照灌注液:成分较为基础,盐溶液部分类似于细胞培养用的PBS溶液,加上头孢曲松和PolySonTM L,而BEx灌注液成分则丰富的多。

动物实验:首先分为4组:

(1)用对照灌注液灌注;

(2)用BEx灌注液灌注;

(3)将未灌流的对照品在室温下于颅内保持10 h PMI,复制第1组和第2组的总PMI;

(4)冲洗1小时的PMI,表示在当前交通条件下最短的组织处理时间。在整个实验期间进行了全局电生理监测、超声检测、Micro-CT脑血管造影、磁共振成像、组织含水量检测、动物组织形态学检测(电镜)、胶质细胞炎症反应实验、脑组织切片电生理、整体脑代谢的测量。

3、结果

① 微循环和血管扩张功能

在停止血液灌注4h后持续BEx灌注6小时,微血管通畅性和扩张功能得以恢复和维持。

a–c,复合多普勒超声检查表明代表性的BEx脑中有大的脑动脉灌注。ACA,大脑前动脉;BA,基底动脉;MCA,大脑中动脉;PA,腓总动脉;PCA,脑后动脉;PCoA,后交通动脉。 d,圆锥周动脉的功率波形分析。 EDV,舒张末期速度;PSV,峰值收缩速度;RI,电阻指数。数据来自a-c中显示的代表性大脑。e,在具有代表性的BEx脑中释放之前,对中心血管进行压缩(预压缩,箭头)之前的皮质血管大体解剖检查,并进行快速静脉补充(箭头)。f–h,在BEx条件下灌注的大脑进行的整体计算机断层摄影血管造影的最大强度投影。i,彩色多普勒分析表明尼莫地平(0.3 mg)给药后圆锥膜动脉流量增加。j,尼莫地平给药前后的相对流量变化。

② 组织完整性

作者通过T1加权MRI评估整体解剖学完整性。在BEx灌注的条件下,神经解剖结构保持完整,这与正常体内脑相当。然后作者们检测了细胞结构的完整性,最终发现BEx灌注效果最好,与正常猪差别最小。

a,灌注和未灌注猪脑的T1加权MRI扫描。在所有三个平面中,侧脑室(LV)的轮廓以绿色显示。箭头,由于气体积聚造成的掉落信号;插图,皮层下解剖标志和灰白色对比。 LCC和APD可作为脑肿胀和心室形态的代表。b,用于干湿质量分析的组织采样位置(红色)。 c,各实验组的组织含水量。

细胞结构完整性,神经元和caspase 3激活的分析。a,描述区域细胞结构完整性的海马尼氏染色。插图,将装有BEx灌注液的容器与对照灌注液条件进行比较。b,具有较高放大倍率场(右侧)的代表性视场(左)对应于CA1和齿状回的框状区域。比例尺,200μm(左),50μm(右)。c,d,CA1(c)和齿状回(d)中的神经元细胞密度。e,CA1中具有肿胀形态的细胞百分比。f,在CA1(左)和齿状回(右)中用DAPI复染(蓝色)对NeuN(绿色)或actCASP3(绿色)进行免疫荧光染色的共聚焦图像。对于actCASP3图像,右边的图像表示方框区域的放大。比例尺,50μm(NeuN / DAPI),50μm(actCASP3 / DAPI,左),10μm(actCASP3 / DAPI,右)。g,h,CA1和齿状回中actCASP3-阳性核的标准化百分比。

③ 神经元和髓鞘轴突活性

作者采用免疫组化、焦油紫染色等方式对神经元及髓鞘轴突活性的不同方面进行了检测。

灌注和未灌注脑中caspase 3激活的动力学。a,前额叶皮层中actCASP3(绿色)的免疫荧光染色的共聚焦最大强度投影。方框区域在下面放大。比例尺,50μm(顶部); 10μm(底部)。图像来自每种情况的代表性大脑;每组n = 6个独立的大脑重复进行实验,结果相似。b,标准化的actCASP3-阳性细胞核的定量。单向方差分析(P <0.001,F [3,20] = 82.3),经过事后Dunnett调整。n =每个条件6个大脑。平均值±s.e.m。c,在CA1领域,齿状回和前额叶新皮层的各种PMI处,未灌注(10 h PMI)脑中actCASP3定位的时程分析。在PMI达到1小时时,所有大脑区域都有强大的核定位actCASP3;但是,该信号随PMI的增加而减小。

分析新皮层的细胞结构完整性,神经元形态和密度。 a,前额叶新皮层的Nissl染色,下面的方框部分具有更高的放大倍数,表明BEx脑中保存的神经元结构和解剖细胞结构。比例尺,350μm(顶部),100μm(底部)。图像来自每种情况的代表性大脑;每组n = 6个独立的大脑重复进行实验,结果相似。b,初级运动皮层的Nissl染色显示在BEx灌注条件下保留的Betz细胞结构(箭头),尽管这些细胞在断头后已被轴突化。尽管进行了类似的大脑区域分析,但问号表示由于细胞的急剧分解,Betz细胞身份的不确定性。图像来自每种情况的代表性大脑;每组在n = 3个独立的大脑中重复进行实验,结果相似。c,前额叶新皮质中NeuN(绿色)的免疫组织化学染色的共聚焦平铺扫描。比例尺,50μm。图像来自每种情况的代表性大脑;每组n = 6个独立的大脑重复进行实验,结果相似。d,NeuN染色的最大强度共聚焦投影。神经元在1小时的PMI脑中表现出肿胀的形态,在10小时的PMI和CP条件下(箭头)显示出明显的细胞破坏,而BEx条件下的神经元则表现出典型的细长形态(箭头)。比例尺,50μm。图像来自每种情况的代表性大脑;每组n = 6个独立的大脑重复进行实验,结果相似。e,NRGN染色的最大强度预测(绿色)显示在BEx灌注下(箭头)保留了皮质锥体神经元的典型形态(箭头),在1 h PMI条件下形态呈肿胀状态(红色箭头)。有证据表明在10 h PMI和CP条件下,清晰的细胞破坏以及液泡增大(箭头)。比例尺,50μm。图像来自每种情况的代表性大脑;每组n = 6个独立的大脑重复进行实验,结果相似。f,GAD1染色的最大强度预测(红色)。在10小时的PMI和CP标本中,GAD1染色显示与1小时的PMI和BEx脑相比,收缩的细胞体(箭头)与GAD1阳性的体细胞接触丧失。比例尺,50μm。图像来自每种情况的代表性大脑;每组n = 6个独立的大脑重复进行实验,结果相似。g,前额叶新皮层中存在的神经元细胞数量。由Nissl污点计算得出的数据。单次方差分析(P <0.001,F [3,20] = 224.6),经过事后Dunnett调整;n =每种条件6个大脑; NS,不重要。h,呈现肿胀的椭圆形形态的细胞百分比。从Nissl污点分析数据。单次方差分析(P <0.001,F [3,20] = 16.33),经过事后Dunnett调整;n =每组6个大脑。平均值±s.e.m。i,j,新皮层中NRGN +和GAD1 +细胞的总数。

有髓新皮质轴突的取向和纤维束密度。 a,前额叶新皮层中MBP的免疫组织化学染色(上图),其高放大倍数图像描绘了纤维的方向和束(下图)。比例尺,100μm(顶部); 50μm(底部)。图像来自每种情况的代表性大脑;每组n = 6个独立的大脑重复进行实验,结果相似。b,在所有实验条件下,分析与轴突表面有关的单个轴突角。 BEx和10 h PMI大脑显示正交于轴突表面的轴突数量增加,而1 h PMI和CP标本显示以更锐角定向的轴突数量增加。通过两尾χ2分析和d.f的Yates校正进行成对比较。= 1,每对比较分析了786个轴突; n =每个条件3个大脑。BEx与1小时PMI的关系:0-30°时χ2 = 6.403,30-60°时χ2 = 4.341,60-90°χ2 = 18.09; BEx与CP:30–60°时χ2 = 4.341,60–90°时χ2 = 11.39。NS,不重要。c,在整个实验条件下有髓纤维束的密度。

④ 胶质细胞结构和炎性功能

作者通过标记染色和LPS诱导炎症反应的方法来检测神经胶质细胞的结构和炎症性功能是否正常,最后发现:BEx灌注不仅可以维持尸体脑组织中的星形胶质细胞和小胶质细胞数量,还可以维持其炎症反应。

分析神经胶质细胞和炎症反应。 a,免疫荧光染色的共聚焦平铺扫描,检查额叶前额叶皮层中的星形胶质细胞(GFAP;红色)和小胶质细胞(IBA1;绿色)。L1,第1层;L2-6,第2-6层;WM,白质。比例尺200μm。b,GFAP +和IBA1 +细胞的共聚焦最大强度预测。比例尺,50μm。c,d分别是IBA1 +和GFAP +细胞的密度。单次方差分析(IBA1 +:P <0.001,F [3,20] = 38.77; GFAP +:P <0.001,F [3,20] = 28.09),采用事后Dunnett调整;n =每组6个大脑。e,LPS注射的大概位置。f,皮层内注射LPS后前额叶新皮层的多重炎症细胞因子和趋化因子谱分析。

海马中的胶质细胞结构。 a,b,CA1(a)和海马齿状回(b)区域中星形胶质细胞(GFAP;红色)和小胶质细胞(IBA-1;绿色)带有DAPI(蓝色)复染的免疫组织化学染色的共聚焦最大强度投影显示BEx灌注条件下神经胶质细胞结构的保存。与1 h PMI对照相比,BEx样品中的神经胶质细胞表现出更具反应性的形态,且细胞过程增厚。比例尺,50μm。图像来自每种情况的代表性大脑;每组在n = 3个独立的大脑中重复进行实验,结果相似。

⑤ 突触组织和神经元活动

作者通过电子显微镜分析发现,与1 h PMI相比,BEx条件下突触前囊泡结构得以保留,并且10 h PMI和CP脑实质性降解。突触前囊泡的定量显示,囊泡池仅在BEx和1h PMI条件下维持正常,而在10h PMI和CP样品中则不复存在。然后,作者进行了电生理检测及脑电图分析,结果也符合上面的规律。

分析突触组织,神经元活动和整体脑代谢。 a,海马CA1原始层内突触的电子显微照片。箭头,突触后密度;橙色阴影,突触前末端。比例尺1μm。b,突触前末端突触小泡的数量。单次方差分析(P <0.001,F [3,8] = 27.13),经过事后Dunnett调整;每个数据点是每个大脑n = 9个突触的平均值;每个条件3个大脑;NS,不重要。平均值±s.e.m。c–e,LPh 4 h后,LOP 6h LOP加BEx灌注液后锥体神经元的电生理特性。c,代表低于和超过阈值的电压迹线,分别响应静态电流为-70 mV的电流的超极化和去极化。刺激大小显示在左侧。 d,由电压依赖性钠和钾通道介导的内向和外向电流族。 e,在-70 mV的保持电位下记录的sEPSC的代表性痕迹。f,ECoG记录BEx灌注大脑的痕迹;来自指定表面电极的代表性等电信号显示在右侧。 g,动静脉梯度和BEx灌注大脑的耗氧量。n = 4个大脑;n =每个时间点每个动脉和静脉样本进行4次配对测量。

⑥ 全脑代谢

作者通过在整个实验过程中比较动脉和静脉样本,最终结果表明,在离体常温条件下, BEx灌注的死后大脑中的整体脑代谢得以恢复。

BEx灌注大脑的动静脉梯度和脑耗氧率。n = 4个大脑;n =每个时间点每个动脉和静脉样本进行4次配对测量。

4、结论

使用这项技术,在延长的PMI后,离体常温条件下可以恢复大型哺乳动物大脑中的微循环以及特定的分子和细胞功能(请参见补充讨论)。这些发现表明,循环停滞后大脑中的分子和细胞退化似乎是一个旷日持久的过程,而不是在单一的,狭窄定义的时间窗口内发生。也许最重要的是,通过适当的干预,哺乳动物的大脑对缺氧或缺血性损伤的代谢和神经生理适应能力仍保持着比目前公认的更高的能力。

5、讨论

研究人员有关代谢,pH和脑灌注的研究结果与生理学参数相一致,据报道这些生理学参数对于遭受全脑缺血的非人类灵长类动物的恢复很重要。在没有更长的灌注研究的情况下,仍不清楚研究人员描述的技术是否能够恢复离体大脑的整体ECoG活性。但是,在BEx灌洗液中加入各种拮抗剂可能会在大脑内产生整体抑制,从而进一步抑制全局网络活动。

如前所述,重要的是要区分神经生理活动的复苏和大脑综合功能的恢复(即神经恢复)。全脑缺氧或局部缺血4小时后观察到的分子和细胞过程的恢复不应推断为正常脑功能的恢复。恰恰相反:研究人员从来没有观察到与意识,知觉或其他高阶大脑功能相关的有组织的全脑电活动。研究人员的技术需要进一步的开发,优化和实施,包括更长的灌注时间研究。这种实验方法可能比本文所述的方法具有更广泛的应用,并且可能潜在地帮助弥合基础神经科学与临床研究之间的鸿沟,尤其是在涉及人脑方面。这种可能性引发了重要的伦理考虑,研究人员、机构董事会和资助机构必须加以解决,要求建立明确的标准操作程序,以排除重新激活并保持可能导致疏忽的残余意识或大脑功能的可能性。

此外,对于研究人员而言,必须以符合目前和未来关于动物源的人道终止的所有现行法规的道德方式采购哺乳动物的大脑(请参阅补充讨论)。总体而言,利用这项技术研究全脑缺氧或局部缺血后大脑神经生理恢复的能力为新型工具提供了基础。研究人员发现了令人鼓舞的证据,这些证据使长时间的循环骤停后的分子和细胞脑功能的时程以及停止作用受到质疑。未来的研究和考虑因素将促进该技术的进一步开发和实施,以研究大型哺乳动物脑中的广泛科学问题。

6、感想

本文设计了一个全新的灌注设备及配套的灌注保护液,并且在家猪大脑停止血液灌注4小时后,持续灌注6小时,能够将家猪大脑的神经细胞功能、血管功能、免疫细胞功能等维持在相对正常的状态。该研究极具创新型及严谨性,发表在Nature主刊上实至名归。

本文的研究可以惠及大量领域。例如急诊领域,当发生外伤等事故时,可以先使用此方法对患者进行灌注保护,然后紧急筹集血浆,进行输血,这样能够增大患者被救活的概率。还有一个重要的应用则是器官移植,根据同样的方法,我们能够将移植器官的保存时间大大延长。并且,未来可以通过这样的方法,将冷冻保护剂送入移植器官中,可以将器官保存在极低的温度下,未来可供移植使用。

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