刘如谦再发论文: 噬菌体辅助实现单碱基编辑器的定向进化,遗传病治疗再下一城!

2020
03/18

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遗传性疾病的治疗一直是一个亟待解决的难题。幸运的是,随着基因组学的发展,越来越多疾病相关的基因被相继发现。

科学家们也由此认识到可以通过改变患者的DNA序列从而从根本上治愈人类遗传病。

2016年4月20日,David Liu(刘如谦)等人在Nature发表论文,在J. Keith Joung的研究基础上首次开发出了单碱基编辑器,在不依赖DNA双链断裂的情况下,实现对单个碱基的定向修改。此后,David Liu的团队不断地对单碱基编辑器进行改进,并与科学界分享他们的研究成果。

2020年3月16日,最新一期Nature Biotechnology在线发表了David Liu团队题为:Phage-assisted evolution of an adenine base editor with improved Cas domain compatibility and activity的研究论文。

该研究通过噬菌体辅助持续进化技术(PACE)获得一种新型腺嘌呤碱基编辑器——ABE8e,与之前的版本ABE7.10相比,其Cas结构域兼容性和活性均有较大改善,并在人体细胞中证实ABE8e的有效性和适用性。

值得一提的是,该论文的作者还有CRISPR/Cas9基因编辑先驱Jennifer Doudna。

碱基编辑器主要由两个部分组成——Cas蛋白和DNA修饰酶。迄今为止,已经开发出两类碱基编辑器:胞嘧啶碱基编辑器(CBE),将C·G转化为T·A;腺嘌呤碱基编辑器(ABE),将A·T转换为C·G。

通过Cas蛋白识别特定的DNA序列,这两类碱基编辑器可以在特定位点实现四种碱基类型的自由转换

(C→T;G→A;A→G;T→C)。值得注意的是,许多人类遗传病是由点突变导致的,CBE和ABE的出现为彻地治愈这些人类遗传病带来了希望!

作为碱基编辑器重要组分之一,SpCas9蛋白识别的DNA序列需要有PAM基序的存在,然而只有大约四分之一的致病性点突变具有适当定位的NGG PAM。为了克服PAM基序的限制,David Liu的团队设计了具有不同Cas同系物的碱基编辑器。

其中,CBE已证明与许多Cas同系物广泛兼容,包括SaCas9、SaCas9-KKH、SaCas9-NG、CP-Cas9s和Cas12a(Cpf1),这极大地扩大了CBE的定位范围。相比之下,ABE与Cas同源物的兼容性有限,即便SaCas9、SaCas9-KKH、SaCas9-NG和CP-Cas9s等与ABE兼容,但是编辑效率大大低于相应的CBE,LbCas12a和enAsCas12a甚至没有显示出ABE活性。

在此项研究中,研究人员试图通过改善ABE与各种Cas结构域的兼容性来扩展其适用性。研究者推测许多non-SpCas9 ABEs的编辑效率不高的原因可能是:腺嘌呤脱氨率(kapp)低以及一些Cas同系物与DNA结合的时间较短。

ABE中的DNA修饰酶是TadA-7.10,这种脱氧腺苷脱氨酶是由David Liu的团队从大肠杆菌tRNA腺苷脱氨酶(TadA)进化而来,并作用于单链DNA。为了提高ABE与多种Cas同系物(SaCas9、SaCas9-KKH、SaCas9-NG、CP-Cas9s、LbCas12a和enAsCas12a等)的兼容性和活性,研究人员开发并应用了一种新的PACE选择系统,并演化出新的ABE突变体——ABE8e。

噬菌体辅助持续进化技术(PACE)也是由David Liu的团队开发出来的一种可以通过驾驭生物进化过程,产生具有指定功能的生物分子。PACE选择系统使定向进化的速度比传统方法快了100倍,实现了生物体“自发”的连续定向进化。

相比于ABE7.10,ABE8e包含8个额外的突变,增加了590倍的碱基编辑活性,研究者将ABE8e与各种Cas同系物配对,其编辑效率得到了极大的提高。此外,ABE8e的过程性更强,这将有利于筛选、干扰调节区域和多重碱基编辑的应用。

正如预期的那样,与ABE7.10相比,ABE8e表现出更多的非靶标RNA和DNA编辑。对此,研究人员通过在TadA结构域中引入V106W突变,从而极大地改善了这种情况。

最后,研究人员还证实了ABE8e可以有效地在人类细胞的BCL11A增强子或HBG启动子中引入自然突变,该突变可以上调胎儿血红蛋白的表达。值得注意的是,ABE7.10对此编辑效率很差。

总而言之,David Liu团队通过噬菌体辅助持续进化技术(PACE)演化出ABE8e,相比于之前的ABE7.10,ABE8e增强了腺嘌呤碱基编辑的有效性和适用性,扩大了ABE的基因编辑范围,

朝着彻底战胜人类遗传病的方向又迈进了一大步!

注:PACE系统主要包含噬菌体模块、细胞内诱导突变模块、及辅助扩增模块。

噬菌体模块:噬菌体M13基因中包装以及侵染宿主菌所需的gIII基因被切除,替换成待进化生物分子的基因;

细胞内诱变模块:利用小分子化合物作为诱导物诱导与DNA复制保真性相关基因突变体表达,提高突变率;

辅助扩增模块:含有噬菌体侵染宿主细胞进行繁殖所需的gIII基因,通过将辅助质粒上gIII的表达与噬菌体模块上待进化目的基因的生物活性关联起来。

进化过程在连续流动的进化池中进行。携带待进化野生型目的基因的噬菌体侵染宿主细胞时,将其遗传物质野生型噬菌体基因组注入宿主菌,利用宿主菌内的复制系统进行遗传物质的复制。与此同时,在阿拉伯糖的诱导下,宿主细胞内诱变质粒上的基因表达,导致噬菌体模块基因组产生突变。若噬菌体模块上目的基因的突变可以启动gIII蛋白的表达,则可以产生具有侵染性的子代噬菌体。这些新产生的子代噬菌体突变株分泌到宿主菌外,感染新的宿主菌并进行下一轮复制增殖,提高自身数量,从而在进化池中存留下来。而无突变的噬菌体模块和不能启动gIII表达的突变噬菌体模块则不能分泌子代噬菌体进行增殖,其数量不会提高,最终从体系中被洗脱。

论文链接:

https://www.nature.com/articles/s41587-020-0453-z

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