韩春雨研究了什么 为何会深陷舆论漩涡

近日，坊间关于韩春雨事件“一个月调查期限已到”呼声日益高涨，韩春雨再次被推到舆论风口。时隔四个月，“网红”韩春雨再次成为公众焦点。出乎意料，《Nature》（《自然》）集团及其旗下刊登韩春雨论文的《Nature Biotechnology》（《自然·生物技术》）杂志面对公众质疑，并未给出明确答复。那么，韩春雨究竟研究了什么，能让他在短短数月内深陷舆论漩涡？

2016年5月2日，《自然》系列顶尖刊物《自然·生物技术》（2015年期刊引证报告该刊影响因子41.514，已超过主刊《自然》影响因子41.456）在线发表了河北科技大学生物科学与工程学院教师韩春雨题为“DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute（利用格氏嗜盐碱杆菌核酸内切酶实现DNA引导的基因组编辑）”的研究成果(见附件)，一时间轰动整个科学界，并很快刷爆朋友圈，不管是否处于科研领域，大家似乎都在转载评论，对韩春雨的赞誉之词也纷至沓来。

但是，随后不久因其它相关实验室（包括一些权威的实验室）抱怨说，该论文结果根本无法重复，导致网络出现了质疑声。尽管有一位匿名研究者告诉《自然》说他可以重复，但是这些质疑和争论随着7月29日澳大利亚国立大学遗传学家Gaetan Burgio在其博客中公开重复实验失败的各种细节，和西班牙国家生物技术中心的遗传学家Lluís Montoliu给国际转基因技术协会会员发的一封邮件的泄露，正式走向国际化。方舟子的质疑和加入，无疑将事件推向了高潮，批评的声音也开始充斥着中国的各个媒体。

面对质疑，韩春雨曾有过为数不多的回应，但均被认为是在搪塞或自圆其说，期间的支持声微乎其微。8月8日，《自然》正式发文就这三个月来持续发酵的“韩春雨事件”给出客观回应（图1），同时刊登韩春雨论文的《自然·生物技术》也开始调查此事，坊间流传调查期限为一个月。

图1 《自然》正式发文对韩春雨事件给出客观回应

9月6日，施普林格·自然集团大中华区总裁刘珺表示：“对于韩春雨论文的调查，我们（自然集团）目前还维持之前的官方回应（将按既定流程调查此事），尚未有新的结果公布。”

言外之意，韩春雨的论文结果到底是真是假还是没有定论。不过可以肯定的是，在《自然》尚未给出最终回应前，韩春雨的论文仍然可以在《自然》官网上找到，有兴趣的读者可以到《自然》官网阅读或下载本文附件阅读。

暂且抛开舆论，勿争结果真假，笔者相信肯定还有很多人并不知道韩春雨论文到底在研究什么？从客观层面来讲，一旦论文结果属实，将会带来什么重要的影响？本文将为大家做一简述。

CRISPR-Cas9的基因编辑地位

通读过韩春雨论文后，知道其焦点在于发现NgAgo-gDNA可以在常温下编辑人类细胞基因组。在正式介绍这一发现之前，先给大家介绍一项与此论文关系非常密切的技术——CRISPR-Cas9，也是一种基因编辑技术，它和NgAgo-gDNA关系密切到什么地步，或可用“既生瑜何生亮”来形容。

CRISPR（clustered regularly interspersed short palindromic repeats，成簇的规律间隔的短回文重复序列），是源于细菌和古细菌的一种后天免疫系统，可利用靶点特异性的RNA（向导RNA，gRNA）指导Cas蛋白对靶点序列进行修饰，如敲除（knockdown）（图2）或插入（knockin）（图3）部分基因、降解外源DNA等，从而实现对病毒或外源质粒再次入侵的免疫应答。

图2 敲除部分基因                              图3 插入部分基因

基于细菌的这种后天免疫防御机制，CRISPR-Cas9技术应运而生，科学家们可以利用RNA引导Cas9（存在于CRISPR位点附近，是一种双链DNA核酸酶）实现对多种细胞基因组的特定位点修饰，换言之，科学家们可以改造基因，改变遗传。

图 4 Cas9切割DNA片段

凭借发现“CRISPR-Cas9”这个基因组编辑工具，两位美女科学家——珍妮弗·杜德娜和艾曼纽·夏邦杰获得了有着“豪华版”诺奖之称的“2015年度生命科学突破奖”，更是获得了素有“诺奖风向标”之称的2015年度化学领域的“引文桂冠奖”，曾被认为是当年诺贝尔化学奖的最有力竞争者，可见这项技术的重要性。

确实，过去几年，CRISPR-Cas9系统已经改变了生物学的研究。CRISPR-Cas9技术是继“ZFN锌指核酸内切酶”和“TALEN类转录激活因子效应物核酸酶”之后出现的第三代基因组定点编辑技术，由于具有成本低、制作简便、快捷高效、毒性小等优点，一出现便迅速占领各市场，成为科研、医疗健康、生产生活等领域的有效工具。

2013年以后，科学家们在包括《Science》（《科学》）和《自然·生物技术》在内的多本著名杂志上发表多篇文章介绍CRISPR-Cas9技术，并且已成功在人类、小鼠、斑马鱼等物种上实现了精确的基因修饰（图5）。

图5 CRISPR-Cas9成功修饰的模式生物

在医疗健康领域可利用CRISPR-Cas9技术介导同源重组来修复人为诱导突变的iPS细胞（诱导多能干细胞）的血红蛋白基因，再将修复的iPS细胞定向诱导分化为造血干细胞移植到体内，从而治疗人类镰刀形贫血症。CRISPR-Cas9技术还可以根除HIV病毒，诱导宫颈癌细胞自我毁灭等，先后被《自然》等著名杂志报道。

CRISPR-Cas9的地位被撼动

但是，CRISPR-Cas9技术仍然存在漏洞，如系统靶向要求较高，最主要的是PAM（Protospacer adjacent motifs-原间隔序列临近基序）必须为NGG（如-GGGCTC-、-GGCG-、-TGGCTT-等）。如果它作为DNA质粒传递进入细胞后，Cas9核酸酶作用增强，不仅会切断靶向基因，还有可能在非目标位点进行酶切，导致“脱靶”编辑，这也是现阶段影响CRISPR-Cas9技术应用的瓶颈之一，对于临床应用来说也是一大败笔。

我们需要更加精确和有效的基因编辑技术来对人类细胞中的基因进行精准编辑。刚好，韩春雨的研究做到了（图6）。

图6 韩春雨在《自然·生物技术》上发表的文章

NgAgo-gDNA 的idea来源

简单说，韩春雨团队发明了一种新的基因编辑技术——NgAgo-gDNA（Natronobacterium gregoryi Argonaute-guide DNA）技术（以下简称NgAgo），研究结果刚出来时，网上有人称之为第四代基因编辑技术，但是在北大和浙大的学术报告上，韩春雨谨慎地表示，“从思路上它和Cas9是一样的，但是它有自己的特点，能否真正成为第四代基因编辑技术，需要在座各位向往科研的科学家们，共同研究开发。”NgAgo和CRISPR-Cas9两者最大的不同在于后者通过RNA寻找替换序列，而前者通过DNA作为介导寻找替换目标。

NgAgo关键在于Argonaute（核酸内切酶家族）。2013年，正当韩春雨和其他研究者们在CRISPR上止步不前时，荷兰瓦赫宁恩大学（Wageningen University）的约翰-范德欧斯特（John van der Oost）研究组发现，Argonaute的同源蛋白酶活可以有效地利用5'-p-ssDNA（单链脱氧核糖核酸）作为短介质，去相对精准地切割基因组靶点。但是，该研究组没有找到能在低温条件下（如37℃）保持活性的细菌Argonaute，这就限制了其在哺乳动物中应用的可能性。韩春雨团队因此受到启发，利用BLAST比对与TtAgo和PfAgo同源性高的可能蛋白，最终锁定了来自于N.gregoryi SP2的Argonaute——NgAgo。

NgAgo的优势

最大的优势在于只有5'磷酸化的DNA（5'-p-ssDNA，哺乳动物体内稀少）才可以介导NgAgo的剪切，且二者的接触时间也会影响剪切效果。如果先转入NgAgo，24 h后再转入5'-p-ssDNA，NgAgo-ssDNA结合明显减少（图7）。

图7 NgAgo和5'-p-ssDNA接触时间影响剪切效果

但NgAgo和5'-p-ssDNA结合具有高度特异性，只有从共转了NgAgo和相应5'-p-ssDNA的才可以对靶标进行剪切，且二者一旦结合，NgAgo便不会兼顾其他DNA，并且只特异性针对目的位点进行切割，从而减少了“脱靶”效应，优于CRISPR-Cas9（图8）。这是文章的立论依据和关键所在，如果这点不成立，那后边的研究都是没用的。

图8 NgAgo和5'-p-ssDNA特异性结合，减少“脱靶”效应

该系统最厉害之处在于，NgAgo的容错率很低，错配一个碱基就会减少NgAgo73%-100%的效率，三个碱基错配时，NgAgo作用基本消失，有效避免了“脱靶”（图9）。而CRISPR-Cas9最高可容忍5个碱基错配，大大降低了修饰效率。

图9 NgAgo容错率很低，三个碱基错配时，NgAgo作用基本消失

对于切割事件的启动，韩春雨在报告里称NgAgo仅受GC丰度限制，而CRISPR-Cas9受PAM区和富含GC序列的限制。

NgAgo在人293T、MCF7、K562和Hela细胞里也取得不错的基因编辑结果(图10)。

图10 NgAgo在人293T、MCF7、K562和Hela细胞中的效果

此外，在插入目的DNA片段方面，NgAgo不仅可以准确插入目的基因（图11b），而且可进行NHEJ（非同源性末端连接）（图11c），且效率不错（图11d）。

图11

NgAgo技术亟待解决的问题

NgAgo目前仅处于研究阶段，尽管科学家们已将Agos应用到了不同物种，如线虫、斑马鱼、拟南芥、酵母等各种模式生物中，但对于NgAgo，正如韩春雨所述，仍有几项需要优先验证的问题：系统正交性、多位点编辑能力、NgAgo蛋白模块化程度（即工程化改造的潜力）以及ssDNA的通用性和缺点。而ssDNA很有可能是NgAgo-gDNA面临的技术瓶颈，因为人类细胞中5'-p-ssDNA并不丰富。

纵观文中应用的各项分子技术，都是已经成熟的，无特别之处，大家都不陌生。但这些普通的技术成就了如此重要的发现，还是那句话：idea是关键。

（注：图2和图3来源于生物谷网站，图4和图5来源于百度文库，其它图片选自韩春雨论文和相关官网，部分内容来源于网络，附件文章仅限读者交流学习之用，如有版权侵犯，请联系本文作者。）