分子克隆：探索基因世界的“复制粘贴”术

分子克隆（Molecular Cloning）是指将目的DNA片段（如一个基因）从复杂的基因组中"复制"出来，并将其插入到一种能够自主复制的载体（如质粒）中，再将这个重组载体导入宿主细胞（如大肠杆菌）进行扩增和表达的过程。简单来说，它就是一个"复制+粘贴"的过程，只不过操作对象是DNA分子。

1、分子克隆的常用方式

1.1 酶切连接

酶切连接法属于经典的分子克隆方法，利用限制性内切酶切割目的基因DNA和载体DNA，再利用DNA连接酶连接DNA，最后转化筛选及纯化，完成重组基因的大量制备。

图1 酶切连接流程

成功的酶切和有效的连接是分子克隆实验圆满完成的必要条件。分子克隆技术中最常用的是Ⅱ型酶，切割后得到的是带粘性末端或平末端的线性DNA。粘性末端，即限制性内切酶在DNA双链上交错切割，形成的核苷酸顺序互补的，可形成氢键的末端（见图2）；平末端，限制性内切酶在DNA双链的相同位置切割DNA分子，这样形式的断裂是形成具有平末端的DNA片段（见图3）。

图2 EcoRI切割DNA形成粘性末端DNA片段

图3 AluI切割DNA形成平末端DNA片段

目前常用的如快速内切酶BsaI、快速内切酶AgeI、快速内切酶EcoRI、快速内切酶HindIII等在内的70款限制性内切酶。

核酸片段可以通过连接酶的作用连接起来而获得重组分子。常用的DNA连接酶是T4 DNA连接酶--T4 DNA Ligase，被称为生物界的"502"。在有Mg2+和ATP存在的条件下，T4 DNA Ligase能催化双链DNA或RNA上相邻的5´-磷酸末端和3´-羟基末端形成磷酸二酯键。

1.2 TOPO克隆

TOPO克隆实际是基于拓扑异构酶的克隆技术，关键是拓扑异构酶。该技术不需要限制性内切酶或外源连接酶，从而提供了将新的PCR产物克隆到质粒中的极其简便快捷的方法，实现"切-粘"一步完成。

TOPO克隆特点：

1）适用于连接平末端和带3'-A的PCR产物。

2）连接反应仅需5min。

3）阳性率高：无自连、零背景，无需蓝白斑筛选，阳性克隆比例高，极少出现空载体。

1.3无缝克隆

基于重组原理的无缝克隆技术，不依赖繁琐的酶切、连接步骤，也不需要末端补平等操作，依据 DNA 片段与线性化载体末端的 15~25nt 同源序列的重组，可将插入片段克隆至任意线性载体的任意位点，载体自连背景极低，是一种简单、快速、高效的 DNA 定向克隆技术。

图4 快速多片段无缝克隆预混液操作流程