多色类器官宝典：肺癌类器官的培养与多色鉴定

一、肺癌类器官构建--Organotial人肺癌类器官培养基试剂盒

（1）取材后的组织须放在预冷的（2-8°C）组织保存液的取样瓶中，快速转运至洁净实验室进行组织处理和细胞分离，拍照并登记信息。

（2）准备若干培养皿，加入 4℃预冷的原代培养缓冲液备用。

（3）取样瓶消毒，将组织放入培养皿中，利用原代培养缓冲液清洗三次后，去除杂质，利用眼科剪或手术刀将组织剪切成体积约为1-3mm3的组织块。

（4）组织用人肺癌原代组织消化液消化，37℃震荡消化10-20min（消化过程中随时观察消化情况）。

（5）取少量液体在显微镜下观察，镜下观察到较多的单个细胞或70um以下的细胞簇后，加入三倍体积原代培养缓冲液终止消化。

（6）使用100um孔径的筛网（abs7009）进行过滤，将滤液收集后，于300g富集离心5min后移去上清，添加原代培养缓冲液重新重悬离心。

（7）基质胶计算：第6步后观察收集到的组织体积，添加25倍组织体积的基质胶重悬铺板。

（8）24孔细胞培养板为例，每孔点胶25ul组织基质胶混合物进行铺板（4℃下操作）。

（9）将铺好的培养板放入37℃培养箱中10-15min成胶，添加人肺癌类器官培养基（恢复室温）进行培养。

二、多重荧光免疫组化鉴定--六色多重荧光免疫组化染色试剂盒

（1）样本制备：类器官样本制备，参考类器官实操大本营之--固定包埋（2）烤片：60℃烤片30min。（3）脱蜡、水化：二甲苯（5min）--二甲苯（5min）--二甲苯（5min）--100%乙醇（5min）--100%乙醇（5min）--95%乙醇（3min）--85%乙醇（3min）--75%乙醇（3min）--去离子水（5min)。（4）抗原修复：取200ml抗原修复液，加入染色盒中，将组织切片置于染色盒内耐高温塑料切片架上，置于高压锅内加热至饱压，然后继续加热5min，关闭电源，10min后取出染色盒，室温冷却30min，画上阻水圈，置入PBST浸洗3次，每次3min。（5）阻断内源性过氧化物酶：每切片加100μL3% H2O2，室温下孵育10min，PBST浸洗3min×3次。（6）封闭：除去PBST液，每张切片加100μL 5% 山羊血清封闭液，室温孵育30min，除去封闭液。（7）一抗孵育：每张切片加100μL一抗工作液，室温保湿孵育1h，PBST浸洗3min×3次。（8）二抗孵育：除去PBST，每张切片加100μL二抗，室温保湿孵育15min，PBST浸洗3次，每次3min。（9）染料孵育：除去PBST，每张切片加100μL现配的1*染料工作液（使用信号放大液按1:100稀释），孵育10min后，置入PBST内洗涤，室温浸片洗涤3次，每次3min。（10）抗体洗脱：抗体洗脱液37℃ 预热，滴加少量抗体洗脱液覆盖样本，室温放置3~5min；弃去洗脱液，再次滴加足量的洗脱液覆盖样本，37°C 孵育20min；PBST浸洗3次，每次3min。（11）重复步骤（6）-（10），直至所有目标抗体染色完成。（12）核染：滴加1*DAPI工作液到样品上，浸没样本区域，室温孵育10min后，用1*PBST浸洗玻片3次，每次2min。（13）封片：滴加抗荧光淬灭封片剂，用盖玻片封片，避免气泡。（14）扫描成像，数据分析。

肺癌类器官多色风采展