药物研发解决方案——残留检测篇

背景介绍

生物药自上世纪 70 年代 DNA 重组技术与单克隆抗体技术出现后开始兴起，1982 年第一个基因重组生物制品胰岛素上市，宣告生物药时代正式拉开序幕。经过40多年的发展，生物药已涵盖生物大分子及细胞，包括抗体药物、疫苗、重组蛋白药物、细胞治疗和基因治疗等。

生物药市场增长迅速，以中国市场为例，2019 - 2023 年中国生物药市场规模以 10.13% 的年复合增长率从 452 亿美元增长至 665 亿美元，预计至 2030 年，中国生物药市场规模将达到 1628 亿美元，2023 - 2030 年的年复合增长率约为 13.64%；全球生物药市场 2018 - 2023 年年复合增长率为 9.0%，预计 2023 年达到 4021 亿美元，2023 - 2030 年年复合增长率为 7.5%，2030 年预计达到 6651 亿美元。

与传统药物相比，生物药的优势主要体现在：

1、作用机制精准，如同钥匙开锁，能高度特异性地与靶点结合，从而发挥治疗作用，减少对正常细胞的损害。

2、治疗效果显著，尤其在一些疑难杂症、慢性疾病以及传统药物难以奏效的疾病领域，能为患者带来新的希望和更有效的治疗手段。

3、具有较低的免疫源性（经过合理设计和生产后），相较于传统化学药可能引发的广泛性副作用，能减少对人体正常生理机能的干扰。

生物药在治疗领域展现出了巨大的潜力，然而，其生产工艺相较于通过化学反应合成的小分子化学药物要复杂得多。生物药的生产涉及工具细胞或细菌的改造及培养，细胞培养过程中温度、营养等条件的细微变化，以及产品加工、纯化、储存和包装等环节的微小差别，都可能对最终产品的质量、纯度、生物特性及临床效果产生显著影响。

由于生产工艺的显著差异，生物药的质量控制面临着诸多独特的挑战，尤其是残留物检测环节。传统化学合成药物的残留检测主要关注反应副产物及杂质等方面，而生物药生产过程中涉及、宿主细胞成分、生产用试剂及可能存在的污染物等诸多复杂因素，其残留物检测的范围和难度也相应增加。对于生物药而言，除了微生物污染和内毒素等残留物外，还需要关注宿主 DNA、宿主蛋白、抗生素、代谢废物、酶等关键残留物的检测。

1、宿主细胞残留检测

生物药往往需要由工具细胞生产，在生产过程中引入的宿主细胞成分残留是质控中的关键检测指标，基于检测成分不同，主要分为宿主细胞蛋白以及宿主细胞DNA；

宿主细胞蛋白（HCP）残留检测 ：

中国药典（2020 年版）规定，针对 CHO 细胞，HCP 残留需要 < 0.05%（相当于小于 500ppm）；针对 E.coli，HCP 残留需要 < 0.01%；

美国药典 USP<1132> 章节规定，用一种灵敏度较高的方法检测药品中的 HCP，其含量应该低于检测限（通常小于 100ppm，即 1mg 总蛋白中 HCP 含量应小于 100ng，也即 < 0.01%）；

欧洲药典 EP 2.6.34 中规定，在生物制品中，HCP 的含量应当小于 0.1%。

国际人用药品注册技术协调会（ICH）指南指出，需要根据 ICH 准则采用敏感且经过验证的有效方法来监控残留的 HCP，其残留量通常要求小于 100ppm。

宿主细胞 DNA（HCD）残留检测 ：通常要求 HCD 残留量在每剂量单位低于特定水平，如 10ng / 剂等，以防止外源性 DNA 对人体的潜在危害。

2、生产工艺添加剂残留检测

生物药生产过程中引入的外源添加剂，需评估检测其残留情况，避免高含量的外源添加剂对人产生不良影响。

培养添加剂--BSA，作为细胞培养过程中的常见添加剂，如在生产环节中有添加使用，需对生物制品中的BSA含量进行检测，如2020版《药典》规定疫苗成品中BSA残留量应不高于50ng/mL或50ng/剂。

培养添加剂--抗生素，抗生素常用于细胞培养中避免污染，或细胞筛选等过程中，如生物制品在生产制备过程中，需在最终成品前尽量去除抗生素。我国在 2020 版《药典》中均规定：生物制品生产过程中加入抗生素的应进行该项检查，成品中所有抗生素累计残留量不得超过 50ng/剂。

生产环节引入物--protein A，作为抗体亲和纯化过程中的关键试剂，常被用于单抗药生产环节中的亲和层析纯化环节，偶联在纯化介质上的protein A会由于材料老化等原因，脱落并进入纯化后的抗体中，导致残留。药典也明确规定protein A的残留量限度，如《药典》2020 年版第三部《尼妥珠单抗注射液》3.1.3.3 中规定，蛋白 A 残留量应不高于蛋白质总量的 0.001%，采用酶联免疫吸附法（通则 3429）进行测定。

生产环节引入物--RNase Inhibitor，在 mRNA 疫苗药物的生产过程中，RNase Inhibitor 可有效抑制反应体系种可能存在的 RNase 活性，从而保护mRNA 不被降解。根据规定，需要对 mRNA 疫苗原液进行各项残留检测，其中 RNase Inhibitor 作为蛋白质品是属于蛋白残留检测项范畴，因此需要对其残留量进行定量检测。

生产环节引入物--RNA聚合酶，在mRNA制备的过程中，T7 RNA聚合酶是最主要的原料之一，是mRNA疫苗和药物研发的核心酶，但是对于药物成品来说是一种杂质，T7 RNA聚合酶可与mRNA一起通过LNP包封进入细胞释放，可被视为外来抗原，其可与互补抗体结合，诱导促炎细胞因子，作为适应性免疫反应的一部分，并导致炎症，从而连带引发mRNA的降解。因此需要更强大的评估方法来检测其残留情况，确保最终产品的质量和安全。

生产环节引入物--胶原酶，胶原酶可用于在体外分离多种组织为单细胞，适用于各种科研用途的器官，组织的单细胞解离。生物制品生产相关法规中明确了细胞培养相关材料检测的必要性，故胶原酶的残留量检测也愈发引起重视。

生产环节引入物--抗体，CAR-T等细胞治疗药物生产过程中，如分选激活、病毒转导、纯化等阶段，都有可能引入抗体类杂质，故抗体的残留量检测也需引起关注。

3、污染物残留检测

在生物药的生产制备过程中，务必严格排查并消除各类潜在污染物，以防对人体造成不良影响。生产环节中常见的污染物主要包括：工具细胞培养阶段可能遭受的支原体污染，以及整个生产流程里可能遭遇的内毒素污染等。对此，《药典》明确要求生物制品必须接受支原体检测，且规定检测灵敏度不得低于每毫升 10 个 CFU。同样，针对内毒素，《药典》也有细致规定。对于白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子等重组细胞因子类生物制品，其内毒素限度通常在每剂 1~5EU；而不同疫苗的内毒素限度各有差异，例如重组乙型肝炎疫苗（酿酒酵母），便要求每剂内毒素含量必须严格控制在少于 5EU 的范围内。

4、杂质检测

生物药因其生产过程的特殊性，还会产生一些特定的副产物，在整个工艺过程中，也要对可能产生的杂质进行特定的检测。如：mRNA疫苗生产过程中，单链mRNA可能聚合，形成双链RNA（dsRNA）杂质；而CAR-T细胞在诱导后，其会分泌炎症因子，在生产过程中也要去除，并检测去除效率。