ELISA 试剂盒实验操作指南

一、准备工作

• 从冰箱中取出试剂盒，待其平衡至室温（20 - 25℃），确保试剂盒内各组分达到最佳反应状态。

• 将未使用的板条连同干燥剂一同放回铝箔袋内，密封后保存于 4℃冰箱中，避免试剂干燥失效。

• 整齐摆放好所需的实验器材，如精准的移液器、干净的离心管、稳固的试管架、喷头顺畅的洗瓶、吸水性强的吸水纸等，为实验操作提供便利条件。

• 仔细检查并准备标准品、检测样本、生物素化抗体工作液、酶结合物工作液、洗板液、显色底物（TMB）、反应终止液等试剂，确保其质量合格、数量充足。

二、加入标准品与检测样本

• 依据试剂盒说明书要求，选用适宜的溶液（如 PBS、样品稀释液）对标准品进行稀释，制备出一系列具有明确浓度梯度的标准品工作液，为后续的标准曲线绘制提供准确依据。

• 根据实验目的和样本特性，对检测样本进行必要的预处理，如离心去除杂质、过滤除菌等操作，并结合实际情况进行适当稀释，以确保样本浓度处于试剂盒检测范围内。

• 使用移液器精准地将标准品工作液和检测样本分别加入到 ELISA 板的对应孔中，每孔加入量严格控制在 100μl。

• 将加样后的 ELISA 板置于 37℃恒温环境，避光孵育 90 分钟，使抗原抗体反应充分进行。

三、洗板

• 孵育结束后，取出 ELISA 板，用洗板液以轻柔且均匀的力度轻轻洗涤 5 次，每次洗涤持续 30 秒，操作过程中注意避免产生气泡，防止干扰后续反应。

• 每次洗涤后，将洗板液彻底倒出，随后用吸水纸轻轻拍干板底，确保孔内无残留液滴，以免影响后续反应的准确性。

四、加入生物素化抗体工作液

• 按照试剂盒说明书指示，使用适当的溶液（例如 PBS、抗体稀释液）对生物素化抗体进行稀释，制备成生物素化抗体工作液，确保其浓度符合实验要求。

• 将生物素化抗体工作液准确加入到每个孔中，每孔加入量为 100μl；对于空白孔，则加入 100μl 生物素化抗体稀释液，作为对照。

• 将 ELISA 板放回 37℃恒温环境，继续避光孵育 60 分钟，使生物素化抗体与抗原 - 抗体复合物充分结合。

五、洗板（同前）

六、加入酶结合物工作液

• 依据试剂盒说明书要求，使用合适的溶液（如 PBS、酶结合物稀释液）对酶结合物进行稀释，制备成酶结合物工作液，保证其活性和浓度稳定。

• 将酶结合物工作液精准地加入到每个孔中，每孔加入量为 100μl；空白孔则加入 100μl 酶结合物稀释液，用于后续结果对比分析。

• 将 ELISA 板置于 37℃恒温环境，避光孵育 30 分钟，使酶结合物与生物素化抗体紧密结合，形成完整的反应体系。

七、洗板（同前）

八、加入显色底物

• 提前预热酶标仪，根据实验需求设置好检测波长、孵育时间等参数，确保仪器处于最佳工作状态。

• 将显色底物（TMB）缓慢而均匀地加入到每个孔中，每孔加入量为 100μl。

• 将 ELISA 板放回 37℃恒温环境，避光孵育 15 分钟，使显色反应充分进行，溶液颜色逐渐发生变化。

九、加入反应终止液

• 孵育时间一到，迅速将反应终止液加入到每个孔中，每孔加入量为 100μl，轻轻晃动 ELISA 板使孔内液体充分混匀，终止显色反应。

• 需要注意的是，TMB 显色液遇酸性溶液会迅速变色，因此加入终止液后必须立即使用酶标仪测量 OD450 值，并妥善保存测量数据，以便后续分析。

十、数据分析

• 收集标准品和检测样本的 OD 值数据，在专业的标准曲线软件或工具中，以标准品浓度为横坐标、OD 值为纵坐标，绘制标准曲线，要求曲线平滑、拟合度高。

• 根据检测样本的 OD 值，在标准曲线上准确查找到对应的目标物质浓度，并结合样本稀释倍数计算出实际含量，为实验结果提供量化依据。

十一、试剂保存

实验结束后，参照试剂盒说明书上的保存条件，将未用完的试剂妥善保存至有效期结束，通常需注意避光、低温保存，防止试剂变质影响后续实验使用。

重要注意事项

• 实验操作全程应严格遵循无菌操作原则，防止微生物污染，影响实验结果的准确性。

• 每个操作步骤都应轻柔进行，尤其是加液、洗板等环节，避免因操作不当产生气泡，干扰反应进程和结果判定。

• 必须严格按照试剂盒说明书规定的步骤、试剂用量、孵育时间和温度等条件进行操作，任何细微的偏差都可能导致实验误差，使结果不可靠。

• 实验结束后，及时清理实验台面，使用合适的消毒剂对台面、器材进行消毒处理，确保实验环境的清洁卫生，防止交叉污染。

建议

• 在正式开展大规模实验前，建议先进行少量样本的验证实验，以确认实验步骤与所选用试剂盒的适配性，熟悉操作流程，提高实验成功率。

• 详细记录实验过程中的各类信息，包括试剂批号、操作时间、温度、样本来源、实验现象等，这些记录对于后续的数据分析、结果解释以及实验的重复开展都具有极其重要的价值，是确保实验科学性和可靠性的重要保障。