全基因组DNA甲基化测序揭示衰老对肝再生的表观基因组调控机制

众所周知，衰老会对肝脏再生产生影响。随着时间的推移，肝脏再生能力显著下降。肝脏体积、血流量和代谢等肝脏生理参数，以及损伤后的再生能力在人类和模型系统中均在老年时表现出下降，其中涉及许多分子机制，包括DNA甲基化依赖性基因组重塑。那么DNA甲基化变化如何介导衰老对肝再生的不利影响呢？

2023年02月13日，美国德克萨斯农工健康科学中心Robert Y. L. Tsai团队在《BMC Biology》杂志发表题为“Epigenome-wide analysis of aging effects on liver regeneration”的研究论文，揭示了衰老对肝脏再生的不利影响。

标题：Epigenome-wide analysis of aging effects on liver regeneration（衰老对肝再生影响的表观基因组分析）

时间：2023-02-13

期刊：BMC Biology

影响因子：5.4

技术平台：WGBS等

研究摘要

本研究利用使用全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）分析了衰老和再生共同调控的小鼠肝脏中的差异甲基化基因组区域（DMR），并鉴定出其相关基因和富集通路。对衰老DMR比对基因的通路分析揭示了衰老的两个不同阶段，即2~8月龄和8~16月龄（months old，m/o）。再生DMR比对的差异表达基因（DEG）在调控细胞增殖和分化的通路中富集。衰老和再生的共有DMR大多数在2~8 m/o阶段以同步的甲基化方向变化（正调控），但在8~16 m/o阶段以反向变化（负调控）。在12个基因的启动子/基因区域中鉴定出再生DMR在8~16 m/o阶段受到衰老的负相关影响。四个再生DEG被早期衰老正调控，并受中晚期衰老DMR负调控。铅DMR比对基因在肝脏衰老和再生中的表达谱进行了验证。

本研究发现了新的DMR和受肝脏衰老和再生的负影响的基因靶点，从而解释了衰老对肝脏再生的不利影响。这些发现对于理解衰老对肝再生生物学的表观基因组变化具有重要意义。

材料方法

材料：雌性C57BL/6小鼠，2-m/o（A2）、8-m/o（A8）、16-m/o（A16）

处理：70%肝部分切除术（PHx）

WGBS：每组4个生物学重复，新鲜冷冻肝组织中纯化基因组DNA，片段化至300–500bp，制备文库、建库测序、DMR分析等。

DEG分析：GEO数据库下载RNA-seq原始数据，进行差异表达基因 （DEG）分析。

qRT-PCR：从肝组织中提取总 RNA，设置6个生物学重复和2个技术重复。

研究结果

（1）2-8-16 m/o 小鼠肝脏衰老 DMR 的全基因组分析

通过WGBS分析2-m/o（A2）、8-m/o（A8）和/或16-m/o（A16）小鼠肝脏之间发生的全基因组DNA甲基化变化。

图1：通过全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）鉴定和表征衰老肝脏中的差异甲基化区域（DMR）。

• 根据三个基线年龄组（A2R0、A8R0和A16R0）的DNA甲基化水平对CpG频率（frequency）分类直方图，其中X轴显示DNA甲基化水平（从0到100%），Y轴显示CpG事件频率。每个图表表示4个生物学重复的平均值。

• 比较8-m/o（A8R0）和2-m/o（A2R0）肝脏（B1），16-m/o（A16R0）和A8R0肝脏（B2），A16R0和A2R0肝脏（B3），衰老DMR的热图。色阶表示Z值，分别用红色或绿色表示甲基化的升高或降低。Hyper-DMR列在hypo-DMR上方。R0表示非再生状态。

• 比较A8R0~A2R0、A16R0~A8R0或A16R0~A2R0肝脏时，hypo-DMR（灰条）和hyper-DMR（黑条）的基因组分布。缩写：rsmk，重复DNA区域；gBody，基因体；TSS，转录起始位点；rep，重复；SINE，短散布的核元件；LINE，长散布的核元件；UTR，非翻译区。Y轴表示在特定感兴趣的基因组区域中发现的总hypo-DMR或hyper-DMR百分比（%）（热点分析）。不同的基因组区域并不相斥。

• 在包含基因结构的基因组区域与基因间区域（D1）或重复序列与非重复序列（D2）中鉴定出的衰老DMR百分比饼图。缩写：TSS-7 k，在TSS上游7kB内；GB，基因体；IG，基因间区域；LINE，长散布的核元件；SINE，短散布的核元件；SimRep：简单重复（微型卫星）；Satellite，卫星重复；Others：UCSC基因组浏览器中RMSK中定义的其他重复类别；nonRep：非重复区域。

图2：衰老肝脏DMR示例和通路分析。

• 基因组浏览器（TRACK）视图显示与Myc和Rai1（A1）相关的两个衰老hyper-DMR，和与GSK3β和Nceh1（A2）相关的两个hypo-DMR。DMR以蓝色阴影突出显示。

• 早期单一、晚期单一、正相关、和负相关类别中的DMR（编号）及其比对基因的数量。

• 使用Hallmark（H）、Canonical Pathway（CP）和Gene Ontology（GO）对四种不同类型的DMR比对基因进行GSEA分析。

（2）肝再生过程中全基因组DMR的鉴定

PHx后1d（A2R1）、2d（A2R2）和4d（A2R4），分析2-m/o（A2）肝脏样本的DNA甲基化水平并将其与手术前收集的非再生样本进行比较来鉴定再生DMR（A2R0）。

图3：通过WGBS鉴定和表征再生肝脏中的DMR。

• 根据三个2-m/o PHx组（A2R1、A2R2和A2R4）的DNA甲基化水平对CpG事件频率进行分类的直方图，其中X轴显示DNA甲基化水平（从0到100%），Y轴显示CpG事件频率。每个图表示四个生物重复样品的平均值。

• 与手术前收集的基线肝脏相比，在70%部分肝切除术（PHx）后1d（A2R1）、2d（A2R2）和4d（A2R4）收集的再生2m/o肝脏中鉴定的再生DMR热图（A2R0）。Hyper-DMR列在hypo-DMR上方。

• 由R1:R0（红色），R2:R0（绿色）和/或R4:R0（蓝色）组共有的特异性和重叠的hypo-DMR和hyper-DMR维恩图。

• 比较A2R2和A2R0肝脏样品，再生DMR的基因组分布。

• 基因组浏览器（TRACK）视图显示与Sox9和Errfi1（E1）相关的两个再生hypo-DMRs和与Cbx6和Akap5（E2）相关的两个hyper-DMRs。

（3）将再生DMR比对到再生中差异表达基因的启动子区域

图4：肝再生过程中将再生DMR比对到差异表达基因（DEG）。

• PHx后肝再生不同时间点DEGs热图。左侧显示上调基因（上，up）和下调基因（下，dn）的数量。小时（h）、天（d）、周（w）。

• 在R1:R0、R2:R0和R4:R0组中，再生hypo-DMR比对的上调DEG（up-DEG）和再生hyper-DMR比对的下调DEG（down-DEG）数量。

C-E. 基因集富集分析（GSEA）显示在R1:R0（C）、R2:R0（D）和R4:R0（E）中分别由再生hypo-DMR和hyper-DMR比对的up-DEGs和down-DEG通路富集。

缩写：H，hallmark；CP，经典通路；GO，基因本体论；FDR，错误发现率；n1/n2，特定通路中富集的DEG数量（n1）/超过不确定DEG数（排除推定基因）（n2）.

（4）显示年龄依赖性变化的再生DMR分析

图5：衰老和再生DMR之间的正相关和负相关变化。

A1. 衰老过程中高甲基化的再生hypo-DMR数量（上）和衰老过程中低甲基化的hyper-DMR数量（下）。A2. PubMed检索与衰老和肝脏相关的出版论文，逆龄再生hypo-DMR（upper panel）或hyper-DMR（lower panel）比对的基因列表，六个显示肝脏相关功能（L），在再生（R）或衰老（A）中有或没有其他功能。

B1. 在肝脏衰老和再生过程中同步低甲基化或高甲基化的DMR数量。

B2. Hallmark (H)和Gene Ontology (GO)通路的列表富集在启动子区域被早期(A8:A2)年龄同步再生的低DMR比对基因中。

（5）再生DEGs启动子区域的年龄依赖性甲基化

图6：再生DEG受衰老DMR负调控。许多再生的up-DEGs和down-DEGs，其启动子区域分别在衰老早期（A8:A2）和衰老中后期（A16:A8）表现出低甲基化或高甲基化水平。其启动子区域由衰老早期DMR正调控并由衰老中后期的DMR负调控的基因，B1：黄色down-DEG，B2：绿色up-DEG，受早期和中后期衰老DMR调控的基因加粗

（6）DMR比对基因在肝脏衰老和再生过程中的表达谱

图7：DMR比对基因在肝脏衰老和/或再生过程中的表达谱。

• 通过qRT-PCR分析衰老DMR比对的c-Myc，Rai1，GSK3β和Nceh1在2-m/o、8-m/o和16-m/o肝脏中的表达，分别用浅灰色、深灰色和黑色条表示。

• PHx后2-m/o肝脏中再生DMR比对的Cbx6、Sox9和Errf1的表达。

• 逆龄再生DMR（C1，C2）比对的两个基因的表达谱和由早期-后期衰老负相关DMR（C3，C4）比对的两个DEG表达谱。

• D1通过解剖肝脏质量（0d）或剩余肝脏质量（1d，2d和4d）与体重的比率分析2-m/o和16-m/o肝脏再生。D2通过高倍视野（HPF= 0.126 mm2）分析Ki67数量评估2-m/o和16-m/o肝脏再生。

• Sox9、Rap2c、Thrsp、Rspry1和Kif4在16 m/o时响应PHx的表达谱。将表达水平相对于Rplp0作为内部参考标准化，并与它们各自的基线（0d）或2-m/o基线（对于E5）样品进行比较。条形代表平均值，六个生物学重复，每个重复两个技术重复（n = 12） 参考同一样品的Rplp0水平*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。

（7）DNA（羟）甲基化酶在肝再生和衰老过程中的表达

图8：肝再生和衰老过程中DNA（羟）甲基化酶表达的变化。

• 通过qRT-PCR在1d、2d、4d和7d的PHx之前（0d）和之后的2-m/o小鼠肝脏中Dnmts（A1）和Tets（A2）的表达。

• DNMT和TET在2-m/o（灰色条）和16-m/o（黑色条）肝脏中的表达。

• 在（0d）之前或在PHx（1d、2d、4d和7d）之后，Dnmts（C1）和Tets（C2）在16-m/o肝脏中的表达。

参考文献：

Wang J, Zhang W, Liu X, Kim M, Zhang K, Tsai RYL. Epigenome-wide analysis of aging effects on liver regeneration. BMC Biol. 2023 Feb 13;21(1):30. pii: 10.1186/s12915-023-01533-1. doi: 10.1186/s12915-023-01533-1. PubMed PMID: 36782243.