癌症-免疫循环，为肿瘤免疫治疗提供思路

分别在2013年和2023年，基因泰克的Ira Mellman在《Immunity》阐述了“Cancer-Immunity ”循环，为业界开发肿瘤免疫治疗提供了一些思考。癌症-免疫循环为理解产生抗肿瘤免疫反应的一系列事件提供了一个框架。它强调反应的迭代性质，即T细胞杀死肿瘤细胞会引发后续轮次的抗原呈递和T细胞刺激，维持活跃的免疫力并使其适应肿瘤进化。循环的任何一步都可能成为限速因素，使免疫系统无法控制肿瘤的生长。Ira Mellman根据过去十年取得的显著进展更新了癌症-免疫循环，拆解了肿瘤免疫的许多步骤：肿瘤抗原释放、抗原呈递、进入淋巴结后的T细胞活化、循环T细胞从外周血进入肿瘤、T细胞肿瘤浸润、二次抗原激活T细胞、细胞毒性T细胞发挥抗肿瘤的作用。对检查点抑制机制的理解已经演变，也改变了对DC在维持抗肿瘤免疫方面作用的看法。此外，还解释了肿瘤微环境在促进而不仅仅是抑制抗癌反应中的作用，并讨论了考虑肿瘤的免疫表型（“免疫类型”）的重要性。虽然这些新的见解增加了循环的一些复杂性，但它们也为研究和治疗干预提供了新的目标。

尽管免疫系统在癌症中的作用已经研究了几十年，但目前的兴趣激增是由临床观察到的结果推动的，这些结果始于使用针对免疫检查点的CTLA4和PD-L1-PD-1的抗体治疗的患者。2013年引入癌症-免疫循环(CI循环)表明，T细胞既不应答也不独立工作，但存在于一系列步骤的背景下，其中一些甚至是免疫系统和癌症的外在步骤(图1)。这些步骤是在一个循环中联系在一起的，这意味着(1)任何单个步骤都有可能限制产生最佳免疫的速率，(2)成功的抗癌免疫有可能在反应过程中自我加强。即使是创造“合成免疫”的治疗策略，如过继细胞疗法、免疫细胞结合抗体的使用或CAR-T/TCR-T细胞疗法，也必须在CI循环的背景下发挥作用。

图1 癌症-免疫循环（CI循环）

在过去的10年里，人们更加关注CI循环每一步背后的机制，在某些情况下，研究改变了一些长期持有的假设(例如，T细胞耗竭的重要性)。然而，对这些步骤的基本理解现在才开始赶上临床数据，这些数据既振兴了该领域，又提供了重要的机制见解。这一差距也在缩小，因为在寻找PD-1轴以外的有效治疗药物方面的进展速度已经放缓。然而，发现新疗法的潜力非常大，但随着人们对周期的每个步骤以及它们是如何结合在一起的更多地了解，发现的速度将会提高。这里总结理解每个步骤方面的进展，并确定下一个10年的关键未知、挑战和机遇。

CI循环框架与肿瘤环境

CI循环的基本框架自引入以来保持不变，包括随后的修改，强调血液来源的T细胞在到达肿瘤本身之前必须经常穿过间质屏障。然而，根据最近的工作，需要强调一些重要的新概念。

即使在个别癌症适应症中，肿瘤仍可被视为呈现不同的免疫表型。免疫炎症、免疫排斥和免疫沙漠三种经典免疫类型分别被定义为含有丰富免疫浸润物的肿瘤、T细胞浸润性仅限于肿瘤间质而不是肿瘤实质的肿瘤，以及不表现免疫浸润性的肿瘤(图2)。免疫表型在不同的适应症中出现的频率不同。例如，未经治疗的前列腺癌、结肠癌和黑色素瘤最常分别表现为沙漠表型、排斥表型和炎症表型。然而，重要的是要认识到，在这些适应症中的任何一种不同的患者中也会出现所有这三种免疫类型；这适用于所有类型的实体肿瘤，无论其来源如何。因此，免疫表型继续代表着一个有用的框架，以了解应答和缺乏应答的机制基础，并指导未来的研究。由于导致这些免疫类型的机制对于开发更好的免疫疗法至关重要，将肿瘤简单地称为“热”(存在T细胞)或“冷”(不存在T细胞)是过于简单化的，确实具有误导性。例如，免疫排斥的肿瘤有T细胞，但T细胞在空间上受到肿瘤细胞的限制，因此通常对检查点抑制具有抵抗力。

图2 免疫表型。

三种主要的免疫类型——免疫沙漠(蓝色)、免疫排斥(黄色)和炎症(红色)。在免疫沙漠中，TME内明显缺乏任何免疫细胞，这可能与免疫细胞的排斥或迁移有关(或者更被动地，缺乏有吸引力的趋化因子)。在免疫排斥肿瘤中，抑制性间质和细胞外基质的存在可能会阻止T细胞有效地迁移到与癌细胞直接接触的地方，使它们被排除在实际的癌细胞巢之外。在炎性肿瘤中，刺激性免疫细胞的存在，包括瘤周或瘤内TLS，可能为TIL提供额外的刺激，增加其功能、生存和增殖。

肿瘤微环境(TME)似乎在决定免疫类型、免疫轨迹和肿瘤命运方面起着关键作用。不仅是T细胞，而且天然免疫系统的细胞(如单核细胞、粒细胞、NK细胞)和非免疫细胞(如癌症相关成纤维细胞或CAF)都具有特殊的重要性。

有些自相矛盾的是，TME还可以促进抗癌免疫，部分是通过产生肿瘤周围淋巴聚集体或三级淋巴结构(TLS)，这与更好的T细胞反应和临床结果有关。TLSs的组成和频率正在成为与免疫治疗反应相关的关键特征，或许反映了它们在放大TME中抗肿瘤T细胞反应方面的作用。

对循环的理解中，最戏剧性的概念变化与其最基本的特征之一有关：T细胞室的功能及其由DC调节。肿瘤中的T细胞功能障碍通常与耗竭的T细胞(Tex细胞)的积累有关，Tex细胞是指活着但效应活性降低的细胞。Tex细胞的特征是多种共抑制受体的表达增加，其中最重要的是PD-1，但也包括LAG3、TIM3和TIGIT；这些受体也是T细胞激活的标志。然而，鉴于它们在衰竭状态下的表达增加，普遍认为，阻断共抑制受体与其各自受体结合的能力将逆转衰竭，重振抗肿瘤活性。对于PD-1和TIGIT来说尤其如此，它们的配体在肿瘤细胞上往往增加。如果没有这种逆转，认为Tex细胞作为效应器将保持次优活性，因为它们的细胞溶解因子(如颗粒酶)和细胞因子的含量很低。

然而，在过去的几年里，关于检查站抑制的作用的看法发生了很大的变化。Tex细胞获得了不容易逆转的严重改变的表观遗传状态。因此，它们可能反映了一条终末分化路径，该路径不太可能是检查点抑制的唯一或最相关的目标。此外，就PD-1而言，PD-L1的最重要来源可能不是肿瘤细胞，而是最初刺激肿瘤特异性T细胞的抗原提呈DC细胞。因此，检查点阻断可能不是为了逆转衰竭，而是为了防止衰竭表型的发展，并在T细胞终末分化途径的早期这样做。此外，这些发现强调DC不仅可能在引流淋巴结(dLN)中启动或激活T细胞反应，而且在支持到达肿瘤后的T细胞反应中也可能发挥关键作用。

除了检查点抑制剂，其中3个生物靶点已被批准用于临床(靶向CTLA4、PD-L1/PD-1、LAG-3)或正在进行晚期临床试验(靶向TIGIT)，在过去的十年中，还没有任何真正的治疗突破通过改变内源性肿瘤免疫来发挥作用。癌症疫苗在转移前的最新进展可能预示着下一步的重大进展。

鉴于DC现在被认为不仅是在CI循环早期(包括内源性和接种后)启动T细胞反应的关键，而且也是维持T细胞反应的关键，DC激活或“成熟”的调节正在重新成为驱动CI循环的关键因素。在这一点上，I型IFN可能是最重要的成分，以及诱导干扰素反应的各种药物(例如，STING、免疫原性脂质、某些TLR配体、胞质传感器如MDA5和RIG-I，DNA损伤反应元件)。

在合成免疫领域，CAR-T细胞和CD3导向的T细胞接合器已成为通过绕过产生内源性T细胞反应的需要而改变恶性血液病CI循环的有效和得到广泛认可的方法。这些方法仍然必须协商CI循环的效应端，受到免疫抑制机制的制约，至少在过继细胞治疗的情况下，DC显然需要优化活性。事实上，过继转移的T细胞(在小鼠模型中)可导致内源性T细胞对注射细胞以外的抗原产生内源性T细胞反应(“抗原扩散”)。这一观察结果与CI循环的一个核心预测一致：T细胞杀伤导致新的或现有T细胞反应的持续和启动。

鉴于这些重大进展，有必要修改CI循环的最初观点，以包括TME，特别是DC在调节和维持抗肿瘤T细胞反应中的关键作用。如图3所示，当dLN来源的T细胞进入肿瘤时(CI循环的第5步)，发生在肿瘤部位的“子循环”最能说明这一点。这些T细胞遇到的抗原提呈细胞(尤其是DC)散布在肿瘤实质、肿瘤相关淋巴集合体或形态可识别的TLS中。然后T细胞可能会扩增和分化，导致直接的肿瘤细胞杀伤，并可能启动CI循环的局部TME“漩涡”。这一观点强调了TME在支持和抑制癌症免疫方面的更重要和更复杂的作用(CI循环步骤5、6、7)。可以想象，这一作用意味着一系列新的潜在治疗靶点。图4突出显示了在CI循环和子循环中影响T细胞行为的一些已知分子或相互作用，以举例说明潜在干预部位的范围。

图3 CI循环与TME肿瘤免疫子循环。

图4 具有刺激因子和抑制因子的癌症免疫循环。

多种刺激和抑制因素可以影响癌症免疫循环每一步的成败。在这里，在每个步骤中提供精选的示例。绿色显示的刺激因素促进免疫，而红色显示的抑制因子有助于抑制反应，用黑色表示的因素可能是刺激因素，也可能是抑制因素。这些列出的因素并不代表一个全面的清单。

TME中DCs的免疫刺激作用

由于DC具有无与伦比的启动和扩展抗原特异性的CD4和CD8 T细胞应答的能力，因此在CI循环中仍然是不可或缺的。在过去的十年中，各种DC亚群和群体的定义和功能鉴定取得了很大的进展。传统的DC1(cDC1)群体仍然是CD8 T细胞肿瘤免疫的最重要的启动者，至少部分反映了它们从肿瘤床到dLN的运输能力，在MHC I类上交叉呈现内在化肿瘤抗原的能力，以及刺激初始CD8 T细胞的能力。这些或其他迁移细胞也可能以某种方式将肿瘤抗原传递给dLN驻留的DC，这代表了抗原交叉呈递到MHC I类和II类分子上的T细胞的第二种选择。其他两类DC也存在，尽管它们的作用不太明确。cDC2通常与MHC II类分子的呈递和刺激CD4反应有关。cDC3也被称为CCR7 DC或mRegDC，也存在于肿瘤内和dLN中，可以迁移，可能根据环境介导免疫刺激或调节功能。

DC在肿瘤中的定位显然是抗癌免疫反应的主要决定因素。那些肿瘤是“免疫沙漠”的患者对免疫治疗几乎完全没有反应，也没有任何T细胞渗透，这表明没有持续的免疫反应。这些肿瘤也缺乏DC，这可能是缺乏反应的主要原因。这种可能性已经在小鼠模型中得到了一些实验支持。如果DC渗透失败是产生免疫沙漠免疫型的罪魁祸首，那么了解这种失败的原因和可能的机械解决方案应该会揭示潜在的治疗干预途径。

DC在免疫和耐受之间保持平衡，在癌症背景下，这可能是一把双刃剑。无论是什么亚群，DC都必须收到一个激活信号，以启动一个“成熟”的终末分化过程，将DC从抗原积累模式转换为抗原递呈模式。当这是促炎或炎性刺激时，成熟的DC促进免疫，调节到刺激的确切性质；当不是时，DC促进耐受。因此，为了产生有效的抗癌反应，积累抗原的DC必须接受适当的激活信号或佐剂。如果TME的炎症性不足，DC将不太可能成熟或产生抗肿瘤T细胞。虽然耐受DC的身份仍不确定，但即使在没有明显炎症刺激的情况下，成熟也会在稳定状态下发生，因为在dLN和脾中可以发现表型成熟的DC(MHC II和CD86升高)。这些DC可能缺乏导致耐受的某些特征(细胞因子产生，高共刺激受体配体)。具有免疫调节特性的成熟DC(mRegDCs，CCR7 DCs)的发现可能在这方面特别有意义。

越来越清楚的是，DC，尤其是位于TME中的DC，在肿瘤中提供了额外的基本功能，即刺激和扩增抗原承诺的记忆或效应性T细胞。早期证据来自小鼠过继细胞转移实验，在有条件地去除DC的动物中，抗肿瘤效果显著减弱。类似地，编码CAR-T靶点(claudin-6)的DC导向的mRNA“疫苗”增强了CAR-T功能。原位方法显示，在人类和小鼠中，肿瘤内的DC与CD4和/或CD8 T细胞(或全部三种)密切相关。

在免疫治疗方面，DC表达PD-L1在控制T细胞反应方面似乎也扮演着不成比例的重要作用也是比总PD-L1表达(包括肿瘤细胞表达)更有效地预测人类癌症患者反应的指标。最后，由于DC提呈抗原，肿瘤中T细胞耗竭的开始可能在肿瘤本身受到控制。综上所述，这些考虑强烈表明，DC在TME中的作用不仅限于将抗原从肿瘤转移到dLNs，还确保肿瘤本身中抗原特异性T细胞的激活和扩增。

CI循环在多个步骤指导T细胞分化和功能

T细胞可以在dLN和TME中被激活和进一步刺激的可能性提出了关于T细胞分化和轨迹控制的重要问题。最初的假设认为T细胞的激活和扩增只发生在dLN(CI循环的第3步)，这表明所有随后的T细胞功能特征都是在那个位置确定的。因此，T细胞是否被指定为耗竭、效应或记忆通路，将由dLN中的抗原提呈条件来确定。由于这一简单的假设似乎不再正确，dLN可能只启动或激活，而终末分化发生在肿瘤部位(步骤5的“子循环”)。也有可能所有这些活动都可以在两个部位发生，在某些情况下，TLS可能作为TME中T细胞启动的部位。

在肿瘤中由DC刺激的T细胞在T细胞功能中发挥关键作用的可能性得到了最近在小鼠模型中的实验的支持。这也与在人类癌症中的工作一致，该工作表明在肿瘤床中也发现了扩增的T细胞克隆类型，尽管它分布在不同的T细胞表型中。在小鼠上的未发表的工作进一步支持了这一解释，表明dLN来源的CD8 T细胞相对于其TCR特异性是多克隆的，但包含在肿瘤到达后分化的单细胞状态中。此外，对人类癌症的研究表明，T细胞(CD4和CD8)可以与肿瘤中的DC一起形成簇或“三位一体”。在所有这些研究中，T细胞只有在到达肿瘤后才能实现终末分化(如，耗竭)。

虽然这里不能详细考虑T细胞的分化和轨迹，但Tex细胞的发育显然与CI循环的功能有关。修订后的观点将表明T细胞在肿瘤水平上致力于衰竭途径，而不是在dLN的初始刺激时。如前所述，事实是终端Tex细胞本身具有很大程度上不可逆的表观遗传状态本身，强烈地表明治疗性检查点抑制不会逆转而是阻止肿瘤内衰竭表型的发展。就共抑制受体PD-1和TIGIT而言，它们的生化机制似乎分别涉及通过CD28和CD226抑制共刺激信号。这反过来表明，阻断PD-1(和TIGIT)可能通过促进共刺激来防止耗竭。DC可能提供PD-L1以及CD28配体B7.1和B7.2(分别为CD80和CD86)的最相关来源，并存在于dLN和肿瘤中。LAG-3介导的共抑制可能以不同的方式发挥作用，但由结合MHC II触发，该类分子也在DC中大量表达(图4)。

最近的证据表明，这两个地理上不同的DC群体在T细胞的发育和衰竭中可以发挥不同的作用。尽管所涉及的T细胞群体的特性和精确轨迹仍未得到很好的描述，但一个吸引人的模型可能是，肿瘤特异性T细胞使dLN处于相对多能的状态，在肿瘤中经历最终的分化，包括形成组织驻留的记忆T细胞和中央记忆T细胞，然后可能再循环。无论模型如何，预测T细胞由肿瘤内的DC引导沿着效应、记忆或衰竭路径分化。要完全理解这个问题还需要做很多额外的工作，但早期的证据足以令人信服地将一个子循环纳入CI循环的第5步，该子循环捕捉到外周DC依赖的T细胞分化的第二阶段。

CI循环及其改进的临床应用

免疫检查点抑制(ICI)，特别是PD-L1/PD-1治疗，在广泛的癌症领域取得了成功，许多患者受益于持久的缓解。这些药物已经成功地从晚期环境进入围手术期环境，降低了手术后的复发率，并改变了特定肿瘤类型的结果。它们在围手术期环境中的活动正在接受随机试验的密集调查。在黑色素瘤中，似乎新辅助治疗方法比辅助治疗更可取。虽然尚未研究这种效果的机制基础，但应用CI循环的逻辑可能预测，在治疗时新抗原负载允许检查点阻断以促进T细胞反应，随后的手术将减少总体肿瘤负担，从而使在新辅助治疗环境中不足以产生持久反应的T细胞数量能够控制辅助治疗环境中的生长。在这个例子中，肿瘤负担可以被视为手术前的速率限制和手术后的T细胞活动率限制。

关于ICI治疗的最佳持续时间和停止治疗后的免疫记忆的问题还没有得到充分的解决。在开始治疗前存在的T细胞免疫状态似乎对预测疗效至关重要，虽然TME的动态变化发生在ICI治疗中，但它们的相关性仍然不确定，需要在临床前和患者中进行进一步研究。在ICI治疗取得最新进展后，再次挑战PD-(L)1治疗似乎与临床益处无关，这表明反应的丧失反映了CI循环中另一个限速步骤的发展。

唯一确定的ICI组合是PD-1和CLTA4抑制，尽管它只在特定的癌症中显示出有效性，并且与许多患者无法耐受的更高毒性有关。CLTA-4的作用机制尚不清楚，它既可以促进新的T细胞反应的启动，也可以去除Tregs，Tregs是CTLA4的高表达，有望抑制抗癌T细胞。因此，抗CTLA4可以在CI循环的两个位置发挥作用(图5)。

图5 已批准和选定的针对癌症免疫循环的研究疗法。

自2013年以来，已经进行了数千项测试癌症免疫疗法药物的临床试验。这导致了许多不同癌症适应症的免疫治疗和免疫治疗方案的批准，突出了最有效的免疫治疗方法。这些被批准的药物和几个正在进行临床测试的精选药物显示在它们主要作用发生的癌症免疫周期的步骤。

通过组合来瞄准CI循环中的不同点是一项既定的战略，尽管结果喜忧参半。第二代免疫疗法，单独或联合使用，还没有成功地建立在基于PD-L1/CTLA-4的治疗的初步成功的基础上。也有一些例外，其中之一是LAG-3，它最近因无进展的生存优势和FDA的批准而在黑色素瘤中引起关注。LAG-3在包括DC在内的一系列免疫细胞上表达。它的主要配体是MHC II类，进一步表明T辅助免疫在癌症免疫中的作用。TIGIT是引起人们重新关注的第二个感兴趣的领域。

其他值得乐观的领域包括个性化的肿瘤疫苗(通常是mRNA)，在黑色素瘤和胰腺癌中具有令人鼓舞的组合数据，后者是一种通常对ICI无效的癌症类型。有趣的是，这两种阳性结果都是在(手术后)佐剂环境中获得的，这表明在高肿瘤负担或根深蒂固的不可允许免疫类型的条件下，单独的疫苗不能产生足够的T细胞反应来发挥临床益处，这些条件下可能至少在手术后短暂地重新编程。由于肿瘤异质性、制造挑战以及TME可能的抑制，其他特异性或效力较差的疫苗平台以前曾在实体肿瘤中苦苦挣扎。了解CI循环限制疫苗有效性的步骤的性质，对于最大限度地增加这种潜在治愈方法的机会非常重要。

单剂CAR-T细胞疗法或T细胞接合剂在靶向相对明确的造血肿瘤中取得了极大的成功：在淋巴瘤中使用CD19或CD20，在骨髓瘤中使用某些白血病和BCMA。然而，在更多的异质性实体肿瘤中，靶点通常表达在宿主组织上，而TME可能在免疫上具有挑战性，结果并不令人印象深刻。实体瘤中的CAR-T细胞可能需要新的靶向、更复杂的细胞工程和基于组合的方法。成功很可能取决于对CI循环的相关步骤的关注。如上所述，临床前数据表明，通过编程DC表达CAR-T靶抗原(claudin-6)可以提高同源细胞治疗的疗效，这可能反映了DC在dLN和肿瘤内支持T细胞反应中的作用(即使在过继细胞治疗后)。

试图通过用非免疫疗法改变TME来将肿瘤转化为免疫反应性癌症应该是一种有效的方法，但到目前为止有限的尝试取得了喜忧参半的结果。VEGF靶向治疗在改变免疫渗透和可能有利于DC成熟方面取得了一些成功，但这一策略的机制尚不清楚。人们对使用TGF-β拮抗剂(抗TGF-β抗体，TGF-β受体激酶抑制剂)很感兴趣，尽管这些试验中的治疗假说可能没有直接解决免疫排斥表型。此外，TGF-β具有高度的多效性，其泛抑制作用与限制剂量的各种毒性有关。到目前为止，针对所有三种TGF-β亚型或受体的尝试在癌症适应症上都被证明是不成功的。最值得注意的是，一项使用可溶性TGF-β受体与抗PD-L1抗体融合的大型试验未能显示出疗效而没有太大毒性，尽管相关部位的分布和药效学活性没有报道。同时抑制两个或更多异构体也可能对疗效本身产生负面影响。TGF-β在CI循环的几个部位可能很重要，而不仅仅是控制基质结构，如Treg和Tscl的产生，因此，尽管到目前为止还没有成功，但似乎有必要进行进一步的研究。

化疗/PD-L1组合取得了成功，可能是通过靶向TME内的免疫耐药，但结果在不同类型的肿瘤中并不一致。探索新的药物，如PARP抑制或CDK4/6抑制或抗体-药物结合物(ADCs)与免疫治疗相结合是有道理的。许多试验正在进行中，不仅应该探索疗效目标，还应该更多地了解这些药物的免疫调节作用。

针对微生物组的研究也取得了初步成功，微生物组调整了宿主的免疫系统，宿主免疫适应性的原理正在形成势头。这种适应性、肠道微生物群和提高免疫治疗疗效之间的联系正在进行临床测试。令人鼓舞的随机II期数据显示，通过用CBM-588等口服制剂改变微生物组，免疫组合的活性得到了增强。

许多新的免疫组合都失败了。它们已经在不同的癌症类型中进行了测试，具有不同的免疫学特征，但没有注意到正在调查的免疫类型。这导致了免疫反应性和抵抗性组织肿瘤(黑色素瘤与胰腺)的假说。虽然这在某种程度上是正确的，但这是一个过于笼统的结论，可以通过考虑接受调查的患者的免疫类型来改进。肿瘤和TME的异质性甚至在经典的非免疫反应性癌症(如前列腺癌)中也显示出免疫谱系的可变性，这表明确实产生了免疫反应，但使其无效。基于PD-(L)1治疗前列腺癌的随机试验在未入选的患者中为阴性，但那些罕见的肿瘤免疫渗透的患者显示出更高的应答率。此外，在小鼠，可能还有人类的实验已经证明了雄激素对CD8T细胞的免疫抑制方面。

总而言之，这些考虑表明，总体的反应机制是多因素的，但不同类型的肿瘤在生物学上是相似的。一个重要的步骤是根据免疫类型对患者进行分类(例如，免疫排斥和免疫炎症都可以是PD-L1阳性)，尽管即使在免疫类型中也可能存在进一步的异质性，这可能会导致应答的可变性。

在过去的十年里，有大量的临床研究表明，先天的、适应性的和免疫无关的生物标记物(如基质生物标记物)都在反应中发挥作用。这还不包括与肿瘤相关的因素，如癌基因等位基因和肿瘤突变负担。敏感性和耐药性的多因素机制意味着，没有单一的生物标记物（如PD-L1或肿瘤突变负荷(TMB)）将单独解释反应。随着CI循环的不同时间点开发新的免疫疗法，将需要替代生物标记物。事实上，修改后的循环增加了发现统一生物标志物的机会，因为它现在调用了以前从未考虑过的额外关键活动(例如，DC或肿瘤中其他抗原呈递细胞对T细胞刺激的要求)。显然，这些将超越PD-L1表达或TMB，甚至可能是研究中的药物类别所特有的，因为不同的药物处理CI循环的不同阶段。

限制临床进展的另一个挑战是，许多组合已经在不太理想的情况下进行了测试，在小型单臂试验中，不同的患者群体之前接受了免疫治疗。许多在特定临床环境中可能有效的组合可能已经过早地被丢弃了。然而，药物开发不成功的例子，如IDO抑制，在没有单剂活性、遗传学或临床前模型中活性的情况下从I期快速进展到III期组合，突显了与不受约束的热情相关的困难。稳健的初始试验是非常可取的，如果要在没有单剂活性的情况下开发药物，必须有一个可测试的治疗假设，人们可以在试验期间进行评估，这样无论试验的疗效结果如何，都可以获得重要的机制和药效学信息。再次回到CI循环等概念的发展：拥有一个清晰的框架，在这个框架内人们可以看到建立和维持有效的抗癌反应所必须采取的步骤，这对于解释复杂的临床结果至关重要。

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