【前沿资讯】CRISPR文库筛选新动向

持续关注CRISPR文库筛选新动态

体外基因编辑技术自问世以来，凭借其精准、简便、高效的特点受到众多研究者的关注，短短几年间已成为基因编辑领域中最热门的技术，被广泛应用于生物、医学等领域。下面跟随小编看看CRISPR文库筛选又有哪些最新的研究动态呢......

一、通过CRISPR文库筛选技术在人类病原体研究中应用的最新动态

肺炎克雷伯菌是一种普遍存在的人类病原体，其临床治疗面临着两个主要挑战：多药耐药和高毒性肺炎克雷伯菌的发病机制。这些基因的发现和研究，可以作为潜在的抗菌靶点，由于其限制了新抗生素的开发，一直是一个研究关注的问题。然而，由于缺乏基本的功能基因组数据，所以在抗菌药物敏感性相关的基本基因机制的研究较少。

在本研究中开发了一种肺炎克雷伯菌CRISPRi文库筛选方法即（Mobile-CRISPRi-seq），识别在体外抗菌适应和体内宿主免疫中发挥关键作用的基因。Mobile-CRISPRi-seq针对肺炎克雷伯菌870个CE基因，发现了甲氧苄啶筛选下四氢叶酸合成途径基因folB和folP的缺失。应用Mobile-CRISRPRi-seq和比较基因组学筛选策略，还鉴定了与多粘菌素和β-内酰胺易感性相关的基因waaE和fldA。此外，利用小鼠感染模型和Mobile-CRISPRi-seq，鉴定了多个毒力基因，在这些基因中，pal、yciS和ribB被证明参与了肺炎克雷伯菌的发病机制。本研究为筛选肺炎克雷伯菌潜在的抗菌靶点和毒力基因提供了一个简单、快速、有效的平台，该广泛应用的系统可扩展用于多种致病菌，特别是革兰氏阴性菌的高通量功能基因研究。www.edgwnw.cn

肺炎克雷伯菌Mobile-CRISPRi基因敲除文库的构建

二、CRISPRi基因抑制文库技术在光合生物微调控机制的最新研究

蓝藻细菌是一种光合生物，在全球碳循环中起着至关重要的作用，并已被广泛用于可持续生产有价值的化学品的微生物。因此，了解蓝藻基因的作用对于指导所有光合生物生物技术应用具有重要意义。

条形码突变体文库是阐明微生物基因功能的有力工具，特别是在多种生长条件下进行筛选时。本研究筛选了一个蓝藻模型的CRISPR干扰库。PCC 6803在11个生物反应器控制的条件下，跨越多个光区和碳源。该基因抑制文库包含21,705个在所有开放阅读框和非编码RNA上都具有高冗余度的个体突变体。多基因抑制在1个条件下是有益的，而在其他条件下通常是有害的，特别是对光捕获和转换有关基因。广泛的数据集将以前很多未验证的基因赋予了重要性，并提出了中枢代谢酶的额外功能。磷酸蛋白激酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和小蛋白CP12对于混合营养和光异养至关重要，这意味着除了在黑暗中的卡尔文循环外，三元配合物对重定向代谢通量也很重要。为了预测sgRNA序列的效力，我们用机器对sgRNA序列和基因抑制数据进行分析，显示了PAM位点近端C富集和T缺失的重要性。所有基因在所有条件下的的适应度数据都被汇编在一个交互式的web应用程序中。对于不同条件下基因的研究和调控机制研究具有重要意义。

聚囊藻CRISPRi文库以5个sgRNAs靶向大多数基因。构建了囊藻的CRISPRi抑制文库。PCC6803靶向3432个基因和1712个ncRNAs。

三、通过CRISPR文库筛选技术在慢病毒载体优化中的应用

慢病毒载体已成为治疗遗传性和获得性人类疾病的有力工具。随着临床研究和商业需求的扩大，对大量纯化慢病毒载体的需求越来越大。

本文通过开发的CRISPR文库筛选方法来识别人类HEK293细胞及其衍生物中的遗传扰动，这可能会增加慢病毒载体滴度。简单地说，基于CRISPRa和敲除文库的慢病毒载体来修饰HEK293和HEK293T细胞。然后扩增这些细胞群，并通过转染整合的慢病毒载体基因组。并重复连续转导和转染的过程。对可能抑制或增强慢病毒载体生产的靶基因的引导RNA（gRNAs）进行了富集，并通过下一代测序（NGS）进行了鉴定。虽然还需要更多的工作来测试在这个筛选中确定的基因，但在这里确定的基因的扰动是一种抗病毒先天免疫的抑制剂，以产生提高慢病毒载体生产力的细胞系。

  CRISPR敲除文库筛选以确定影响慢病毒载体生产的基因组靶标实验流程

参考文献

1.Construction and application of the conditionally essential gene knockdown library in Klebsiella pneumoniae to screen potential antimicrobial targets and virulence genes via Mobile-CRISPRiseq.

2.CRISPR interference screens reveal growth–robustness tradeoffs in Synechocystis sp. PCC 6803 across growth conditions.

3.CRISPR library screening to develop HEK293-derived cell lines with improved lentiviral vector titers.