快报｜一种基于生物条形码的新型结核分枝杆菌传感器

作者：魏擅红，窦艳枝，于媛媛，杨景卉，余方友，沙巍，李铁

第一作者及单位：魏擅红，中国科学院上海微系统与信息技术研究所传感技术实验室

通信作者及单位：李铁，中国科学院上海微系统与信息技术研究所传感器技术实验室；沙巍，同济大学附属上海市肺科医院/上海市感染性疾病（结核病）临床医学研究中心

A novel biosensor based on a bio-barcode for the detection of Mycobacterium tuberculosis.

Wei S, Dou Y, Yu Y, Yang J, Yu F, Sha W, Li T.

Anal Methods，2023，15(30)：3683-3691.

doi: 10.1039/d3ay00772c.

PMID: 37464896.

背景

结核病是世界上最紧迫的公共卫生问题之一。根据2022年世界卫生组织（WHO）全球结核病报告显示，2021年全球约1060万例新发结核病患者，死亡160万例，而结核病的确诊率却只有63%。目前的结核病确诊手段主要是分枝杆菌培养、抗酸杆菌涂片镜检及分子生物学诊断，但分枝杆菌培养耗时长、涂片镜检的敏感度低、分子生物学诊断耗时长且花费高。因此，开发一种简单、快速、准确、敏感的结核分枝杆菌检测方法尤为重要。

本文介绍了一种结合磁分离、脲酶催化与硅纳米线场效应晶体管（silicon nanowire field effect transistor，SiNW FET）监测的用于结核分枝杆菌DNA检测的简单、快速且敏感的新型生物传感器。结核分枝杆菌DNA被一对结合在磁性纳米颗粒和脲酶标记的二氧化硅（SiO2）纳米颗粒表面的互补探针DNA捕获，形成“三明治复合物”；尿素通过这个“三明治复合物”中的脲酶催化成碳酸铵；通过SiNW FET对不同浓度碳酸铵的电流变化实现结核分枝杆菌DNA的定量检测。该生物传感器的检测限（LOD）低至78.541 fm。此外，该生物传感器可以明显区分结核分枝杆菌与其他干扰细菌。因此，该生物传感器可准确、快速、敏感地检测结核分枝杆菌DNA，在临床诊断领域具有巨大的应用潜力。

研究方法

1.SiNW FET的制造与修饰：在SiNW FET制造上，基于硅的各向异性腐蚀和自限制氧化等工艺，制备得到晶圆级SiNW FET。在SiNW FET修饰上，首先用氧等离子体处理SiNW的表面15 min以修饰羟基；然后在室温下将器件置于APTES溶液中孵育过夜，将氨基引入SiNW表面；再次用乙醇漂洗器件并用氮气吹干；最后器件在120 ℃烘干箱中放置15 min后，制成具有稳定单层氨基的SiNW生物传感器。在纳米颗粒修饰上，基于链酶亲和素与生物素的特异性结合，将生物素修饰的DNA探针1（bio-DNA）组装到链酶亲和素修饰的磁性纳米粒子上（DNA1-MNPs）以捕获结核分枝杆菌DNA并实现富集分离。将地高辛修饰的DNA探针2 （dig-DNA）和脲酶分别固定在二氧化硅纳米颗粒表面（DNA2-SiO2NPs）以捕获结核分枝杆菌DNA并催化尿素。

2.结核分枝杆菌DNA的分离与检测：基于碱基互补配对原则和酶促反应，对结核分枝杆菌DNA进行分离并检测。将体积为100 μl、浓度从1～107 pM的结核分枝杆菌DNA样本分别加至含有100 μl DNA1-MNPs与100 μl DNA2-SiO2NPs的混合溶液中，然后在室温下振荡孵育1 h以形成MNPs-DNA1-结核分枝杆菌DNA-DNA2-SiO2 NPs（MNPs-DNA-SiO2NPs）复合物。清洗后，将MNPs-DNA-SiO2 NPs复合物悬浮在1 ml 10 mg/ml尿素溶液中，在室温下振荡20 min，利用SiO2NPs上的脲酶将尿素水解为(NH4)2CO3。磁性分离MNPs-DNA-SiO2NPs复合物后，将上清液滴加到SiNW生物传感器上检测(NH4)2CO3浓度变化。该新型生物传感器通过对(NH4)2CO3的浓度检测间接实现对结核分枝杆菌DNA浓度的测定。具体见表1。

3.结核分枝杆菌DNA的准备：利用DNA分离试剂盒，从培养的结核分枝杆菌中提取基因组DNA。通过UV-vis测量260 nm和330 nm处的吸光度值，并在软件中计算与定量浓度。

研究结果

1.生物传感器原理：传感示意图如图1a所示。在图1b和1c中，SiNW器件的源漏电流随(NH4)2CO3浓度的增加而降低，而对不同浓度的尿素溶液没有明显的电流变化，表明该传感器方法具有可行性。

2.生物传感器特性：通过“自上而下”的方法制造可批量制备且完全可控的p型SiNW传感器（图2a）。每根SiNW（图2b）的长度约为70 nm且形状为高度一致的三角形，较大的表面积可使其对周围电场变化具有高度敏感性。如图2c～2j所示，通过透射电子显微镜（TEM）、傅立叶变换红外光谱（FTIR）、紫外可见分光光度计（UV-vis）与聚丙烯酰胺凝胶电泳（Page）的表征结果表明，捕获探针在MNPs与SiO2NPs上的成功修饰与MNPs-DNA-SiO2NPs复合物的形成。

3. 生物传感器的优化：如图3所示，本文分别优化了脲酶浓度、尿素浓度与催化时间、SiO2NPs大小及其浓度。优化实验的结果表明，脲酶溶液的最佳浓度为10 mg/ml，尿素溶液的最佳浓度为100 mmol/L，最佳催化时间为20 min，SiO2NPs的最佳大小及浓度分别为50 nm与100 mg/ml。

4.生物传感器对结核分枝杆菌DNA的敏感度检测：如图4a所示，随着结核分枝杆菌DNA浓度的增加，SiNW FET的电流逐渐减小。此外，在结核分枝杆菌DNA 1 pM至1 μM浓度范围内，|∆I/I0|与其浓度线性相关且相关性高（R2=0.978）。通过与现有结核分枝杆菌DNA检测方法的比较，该生物传感器的检测下限与检测范围均较优（表2）。

5.生物传感器的特异性、稳定性和重复性：如图5a所示，干扰物的电流变化不大，只有结核分枝杆菌DNA能引起SiNW FET产生较大的|∆I/I0|变化。图5b、5c分别显示了传感器在4 ℃下保存10 d与重复5次实验的测试结果，SiNW FET电流几乎不变。以上实验验证了生物传感器具有优异的特异性、稳定性以及重复性。

6.检测真实样本中的结核分枝杆菌DNA：为了评估SiNW FET的临床实用性，通过将培养的结核分枝杆菌中的fadE15 ssDNA进行扩增，而后将其加入结核分枝杆菌阴性的痰中进行检测。如表3所示，结核分枝杆菌阴性的痰中fadE15 ssDNA的回收率在90.401% ~ 109.988%之间。因此，我们提出的新型生物传感器有望成为临床诊断中检测结核分枝杆菌的可靠手段。

讨   论

本文构建的生物传感器不仅具有操作简单、特异度高、检测范围宽、成本低的优点，而且还具有SiNW FET的高敏感度和快速响应等优点，为结核分枝杆菌的临床检测提供了新思路。

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供稿：于媛媛

编辑：孟   莉

审校：范永德