Nature | 胞内的“锁眼”：B1类GPCR的胞内激动剂结合位

作为人体内最大的蛋白家族，目前市场上约30%的药物都靶向G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor,GPCR)1。通常来说，激动剂于与GPCR胞外正构口袋的结合可以引起受体构象改变2。除了正构位点之外，GPCR还存在许多别构位点，结合于别构位点的配体使受体具备亚型特异性3。

甲状旁腺激素1型受体(parathyroid hormone type 1 receptor, PTH1R) 属于B1类GPCR，是矿物金属离子稳态和骨代谢的主要调节蛋白，可以响应甲状旁腺激素(parathyroid hormone, PTH)和甲状旁腺激素相关肽(parathyroid hormone-related peptide, PTHrP)，并活化下游Gs、Gq和β-arrestin3。细胞膜上Gs间断性活化会间歇性地产生cAMP，然而，活化的PTH1R会在β-arrestin的作用下发生内吞，导致早期内体中cAMP的持续性生成，进而产生副作用(图1)4。因此，G蛋白的偏向激动剂在骨质疏松的治疗中具有重要的作用。

图1.PTH1R的活化机制4

目前较为常见的偏向激动剂通常结合与GPCR穿膜区近胞外侧，然而，结合胞内侧的激动剂，尤其是结合与受体与G蛋白互作界面的偏向激动剂，可能对受体的偏向激活更有利5。现有的6个GPCR与胞内配体结合的结构绝大多数为拮抗剂结合的结构，这限制了人们对胞内偏向激动剂结合和调节的理解。

2023年6月7日，来自日本东京大学的Osamu Nureki、千叶大学的Takeshi Murata和东北大学的Asuka Inoue共同通讯，在Nature上在线发表了一篇题为Class B1 GPCR activation by an intracellular agonist的科研论文。文章报道了PTH1R与Gs形成的复合物结合激动剂PCO371的冷冻电镜结构，发现PCO371结合在PTH1R的胞内口袋并直接与Gs相互作用。本研究鉴定了一个新的、保守的激动剂胞内结合口袋，为受体-信号转导蛋白互作界面上的偏向激活提供了分子尺度的证据。

结构解析所用的PTH1R为HEK293细胞表达，在使用LMNG和CHS溶膜后，GDN和CHS被用于后续的蛋白纯化，此外，研究者在纯化过程中添加了PCO371，同时为提升PCO371的溶解度进一步优化使用了pH 9.0的缓冲体系。通过混合PCO371结合的PTH1R、mini Gs异源三聚体以及Nb35，研究者获得了稳定的复合物，冷冻电镜数据采集和后续分析得到的密度图整体分辨率达2.9 Å (图2)。在该密度图中，PCO371-PTH1R-Gs复合物的二级结构和侧链取向可以被较好地确定。

图2.PCO371-PTH1R-Gs复合物的整体结构

PCO371结合于TM2、TM3、TM6和TM7形成的胞内信号转导蛋白结合口袋中(图2,图3)，而非正构位点，这在过去已发表的B1类GPCR与激动剂结合的结构中还从未被观察到过。PCO371与该位点的相互作用绝大部分由范德华力和疏水相互作用介导，Tyr4597.57与Val4126.44以及PCO371之间形成的氢键进一步稳定了整个复合物。值得注意的是，PCO371的DMH(dimethylhydantoin)基团与Gαs C端hook结构相互作用，将PCO371紧包裹在受体核心内。该结构足以清晰表明PCO371是一种结合于Gs和受体胞内腔的激动剂。

图3.PCO371结合部位的局部相互作用

通过将本文复合物与PTH-PTH1R-Gs复合物以及ePTH(engineered PTH)-PTH1R-Gs复合物进行结构比对，研究者发现PCO371结合的活化状态与另外两者存在显著的构象差异(PTH-PTH1R-Gs具备活化的B1类GPCR的结构特征，而ePTH-PTH1R-Gs复合物表现出失活的结构特征)：首先，在PCO371结合时，PTH1R的TM1、TM6和TM7近胞外段分别向外移动了约6Å、6Å和4Å，TM6的近胞内段因而产生显著外移；此外，PTH1R的TM6呈现中度弯曲状态，这是其它活化的B1类GPCR所不具备的结构特征(图4)。

图4.PCO371结合时PTH1R的构象变化

为进一步阐明PCO371导致PTH1R活化的机制，研究者B1类GPCR 3个关键的基序进行了比对，包括PYQ活化基序(Pro6.47-Tyr6.53-Gln7.49 active motif)、PxxG开关(Pro6.47-x-x-Gly6.50)和HETY失活基序(His2.50-Glu3.50-Thr6.42-Tyr7.59)。比对结果发现，在PTH结合时，PYQ活化基序的氢键网络会发生重排，导致TM6中PxxG基序的弯折，最终产生一个能够稳定TM6胞内部分向外的疏水簇，同时打开G蛋白结合的胞内腔。而在PCO371结合时，与ePTH结合时类似，PYQ活化基序和PxxG开关发生形变，PCO371的三氟甲氧基苯和螺环咪唑酮会与ePTH结合结构中的Val4126.44以及Phe4176.49产生空间位阻，PCO371的结合导致TM6在Pro4156.47处局部解旋，从而避免这种位阻的产生，提示该残基在PCO371介导PTH1R活化中有重要作用(图5)。此外，研究者还发现PCO371作为分子楔稳定发挥作用，在其作用下，TM6向外移动构象得到稳定，从而产生容纳G蛋白的腔隙，导致G蛋白的偏向激活。

图5.PCO371导致PTH1R活化的机制

PCO371在PTH1R上的结合口袋在B1类GPCR中高度保守，细胞水平的实验证实，在15种B1类GPCR中，PCO371能够激活其中的7种。结合进化水平的分析以及突变验证，再次证实了Pro4156.47在PCO371导致的活化中发挥的重要作用。

图6.PCO371与肽类激动剂活化机制的差异

与过去报道的结构不同，PCO371的活化无需胞外构象变化，其直接与PTH1R胞内信号传导蛋白结合口袋相互作用，提示PCO371能够像脂质一样穿过细胞膜，直接作用于蛋白的胞内部分或穿膜区。与引起TM6弯折的肽类激动剂不同，PCO371会在Pro4156.47处局部松解TM6的螺旋结构，从而发挥其活性(图6)。综上，本文的结构揭示了PTH1R一个新的细胞内激动剂口袋，由此阐明了一种非典型的激活过程。

参考文献

1.Hauser, A. S., Attwood, M. M., Rask-Andersen, M., Schiöth, H. B. & Gloriam, D. E. Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications. Nat. Rev. Drug Discov. 16, 829–842 (2017).

2.Katritch, V., Cherezov, V. & Stevens, R. C. Diversity and modularity of G protein-coupled receptor structures. Trends Pharmacol. Sci. 33, 17–27 (2012).

3.Smith, J. S., Lefkowitz, R. J. & Rajagopal, S. Biased signalling: from simple switches to allosteric microprocessors. Nat. Rev. Drug Discov. 17, 243–260 (2018).

4.Yavropoulou, Maria & Michopoulos, Alexandros & Yovos, John. (2017). PTH and PTHR1 in osteocytes. New insights into old partners. Hormones. 16. 150-160. 10.14310/horm.2002.1730.

5.Ortiz Zacarías, N. V., Lenselink, E. B., IJzerman, A. P., Handel, T. M. & Heitman, L. H. Intracellular receptor modulation: novel approach to target GPCRs. Trends Pharmacol. Sci. 39, 547–559 (2018).

供稿|王彤彤

审稿|丛野

责编|囡囡

排版|可洲