融合蛋白标签

今天来学习蛋白标签。

由于过继性T细胞转移和免疫检查点阻断的成功，肿瘤免疫治疗已经成为临床现实。癌症疫苗接种可能会追随他们的脚步，因为它应该提供利用适应性免疫的力量来识别和消除恶性细胞的最终手段，同时建立长期的t细胞记忆反应，防止复发。然而，有效的癌症疫苗已被证明是难以捉摸的。虽然亚单位(或分子定义的)疫苗可以组装成包含三种主要疫苗成分——抗原、佐剂和递送成分——但优化疫苗的一个主要障碍是将抗原靶向免疫系统中产生免疫反应的特定部位(如引流淋巴组织)。然而，尽管有巧妙的设计和多种策略，制定高免疫原性抗原仍然是一个障碍。

优化抗原-蛋白融合以实现高效疫苗接种

a，上:最低免疫原性蛋白(如小鼠血清白蛋白)的药代动力学模型。蛋白质的吸光度(kabs)和清除率(Kclear)决定了注射后的总体生物利用度以及其进入淋巴结和远端淋巴器官的途径。下图:抗原-蛋白融合的设计，肽抗原通过多组氨酸(His)标签和柔性多肽蛋白标签放置在载体蛋白(小鼠血清白蛋白)的末端。

b、小合成肽的皮下递送导致其全身扩散，并在几乎所有表达MHC- 1分子的有核细胞中呈现。相比之下，优化后的抗原-蛋白融合选择性地到达引流注射部位的淋巴结，并可由专业抗原呈递细胞呈递。这种不同的命运决定了耐受(非选择性呈递)或免疫(选择性呈递)的诱导。

在疫苗配方中，合成肽可以模拟肿瘤抗原。以抗原特异性方式激活肿瘤侵袭性细胞溶解CD8+ T细胞反应的肽通常为9到10个氨基酸长，而且这种短肽易于配制和制造。然而，它们的体外抗原性往往不能转化为体内很强的免疫原性。事实上，注射合成肽抗原反而可能导致免疫耐受的诱导和体内相应抗原特异性T细胞的缺失。通过它们与非专业抗原呈递细胞表面的主要组织相容性复合体(MHC)- 1分子的结合。因此，为了触发生产性免疫反应，基于合成肽抗原的疫苗需要选择性地与抗原呈递细胞上的先天免疫受体配体一起递送到次级淋巴器官(淋巴结)。将肽疫苗输送到淋巴结的一种有效方法是将合成的肽抗原与免疫原性差的载体蛋白融合(以免使免疫反应偏离肿瘤抗原)，注射后从皮下间隙排出到淋巴结。

Darrell J. Irvine、K. Dane Wittrup及其同事在《自然生物医学工程》杂志上发表的报告显示，肽抗原和载体蛋白的生化融合可以被优化，使免疫接种部位的淋巴管有效吸收，从而保护抗原表位免受组织蛋白酶的侵害，减少远端非炎症部位不需要的抗原呈递。用含有载体蛋白转甲状腺素的疫苗配方免疫小鼠，可使疫苗的免疫原性提高90倍，并增强病毒抗原、肿瘤相关抗原、肿瘤胎儿抗原和共享新抗原的免疫原性。

Irvine和他的合作者首先检测了作为多种肿瘤抗原肽载体的最低免疫原性蛋白的药代动力学特性——自体蛋白，如血清白蛋白、前白蛋白(也称为转甲状腺素)和抗体的Fc部分。

对注射部位进入体循环的吸收率(kab)和从体循环的清除率(Kdear)的分析表明，必须保持平衡，以实现最小的全身吸收和最大的淋巴吸收，同时确保快速从循环中清除(图1a，顶部)。作者发现，蛋白质载体的分子大小与kabs呈负相关，体积较大的蛋白质在皮下注射后全身吸收率较低。事实上，分子量小于4 kDa的分子(相当于约30个氨基酸的肽抗原，因此比典型的合成肽抗原大)被全身吸收，这在针对淋巴器官的疫苗配方中是不希望的;相反，抗原载体融合体没有被系统显著吸收。因此，通过与大体积蛋白融合来控制kbs提供了一种增加引流淋巴结中抗原融合肽可用性的方法。作者还证实，增加Kelear可以通过减少免疫原的全身扩散及其暴露于远端非炎症淋巴结来进一步改善免疫原性。

抗原-蛋白融合应在设计和可翻译性方面得到改进。可以添加蛋白质结构域以提供关键特征，例如通过淋巴引导迁移的趋化因子线索，抗原呈递细胞的特定靶向结构域或与细胞外基质成分的粘附。此外，蛋白质结构域可能与刺激先天免疫的配体相连。

近年来，随着蛋白质组学领域的迅速发展，重组蛋白的应用也大大增加。亲和标签，用以促进目标多肽的纯化，被广泛应用。许多不同的蛋白质、结构域或肽可以与目标蛋白融合。利用融合蛋白进行重组蛋白的纯化和检测的优势是公认的。然而，对于感兴趣的特定蛋白质，选择合适的纯化系统是困难的。

本文综述了最常用和最有趣的系统:Argtag，钙调素结合肽，纤维素结合结构域，DsbA, c-myc-tag，谷胱甘肽s-转移酶，FLAGtag, HAT-tag, His-tag，麦芽糖结合蛋白，NusA, Stag, sbg -tag, Strep-tag和硫氧还蛋白。

亲和标签的基质及洗脱条件

亲和标签的顺序和大小

多组氨酸二氢叶酸还原酶(DHFR)对Ni2+-NTA吸附剂在6 M盐酸胍(GuHCI)和0.05 M磷酸盐缓冲液中的亲和力(Hochuli et al. 1988)

基于氨基酸残基X1，通过密度测定测定肠激酶的切割(%)(Hosfield and Lu 1999)。

序列…-GSDYKDDDDK-X1ADQLTEEQIA -…在37 ℃下，用0.2 Uof肠激酶消化5mg蛋白16 h，检测GST-cal调节蛋白融合蛋白的分子量

文献来源：

Romero P, Donda A, Hubbell JA. An optimized antigen-protein fusion. Nat Biomed Eng. 2020;4(6):583-584. doi:10.1038/s41551-020-0572-3.

Terpe K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl Microbiol Biotechnol. 2003;60(5):523-533. doi:10.1007/s00253-002-1158-6.

来源：Of Studies/ 医药速览 2023-06-04