了解tRNA基因治疗

超过10%的遗传疾病由阻碍细胞合成完整蛋白质的无义突变导致。使用抑制性转移RNA   (suppressor-tRNA)   的实验性疗法，在核糖体翻译遇到提前终止密码子时，引入对应的氨基酸，能够诱导翻译通读，从而帮助细胞重新产生正常的蛋白质。尽管这项技术可以追溯到近40年前，但生物技术公司终于开始认真对待这一想法，并着手开发基于tRNA的疗法，用于治疗囊性纤维化、Dravet 综合征、Duchenne 肌营养不良症和 Rett 综合征等遗传疾病。虽然前途充满希望，这些疗法仍需要克服所有RNA分子共有的药物递送挑战和tRNA特有的安全问题。    

2021年11月，由Flagship Pioneering孵育的初创公司Alltrna正式宣布揭幕，称自己为”世界上第一家 tRNA平台公司”。通过工程化改造tRNA分子，这家初创公司获得了5000万美元的初始融资支持，旨在解决可能引发各种疾病的错误蛋白质产生机制。其实，Alltrna并不是唯一一家正在开发研究基于tRNA疗法的生物公司。在此之前，ReCode Therapeutics、Shape Therapeutics 和 Tevard Biosciences 等公司都进行过tRNA疗法的研发；随着2022年2月下旬hC Bioscience的成立，tRNA基因治疗领域继续扩大。

目前，这些公司都致力于设计开发tRNA分子，以绕过翻译过程中遇到的提前终止信号并掺入所需的氨基酸，完成蛋白质的正常合成。这种tRNA与天然的tRNA序列大部分相同，但它的反密码子（anticodon）通过碱基配对原则，能识别终止密码子（UAG, UGA, UAA） 。当核糖体在翻译过程中遇到提前终止密码子时，可以引入对应的氨基酸到正在合成的肽链中，诱导通读从而获得具有生物学功能的全长蛋白。理论上，仅仅一个抑制性tRNA就可以治愈数千种不同的罕见遗传疾病。因为这些疾病都是由相同类型的无义突变引起，这些突变使得基因表达提前终止，阻碍正常的全长蛋白质生成，从而导致了不同疾病。

Ryan Cross. Chemical & Engineering News, 34–38 (2021)

尽管tRNA基因治疗技术看似充满了希望，目前尚不确定该平台是否会胜过小分子“通读”药物，例如 Translarna（ataluren）—— 一种在欧洲和巴西获得批准的用于无义突变介导的杜氏肌营养不良症患者的治疗方法。此外，目前正在开发的基因编辑疗法，也可以与 tRNA 药物相媲美。

利用抑制性 tRNA 的活性来纠正人类遗传疾病的想法，可以追溯到大约 40 加州大学旧金山分校的华人科学家简悦威（Yuet Wai Kan） 博士的研究。1982 年，研究 β-地中海贫血（一种通常由血红蛋白-β 基因的无义突变引起的疾病）的研究人员发现，设计用于读取提前终止密码子的 tRNA， 可以帮助恢复蛙卵中全长蛋白质的产生。2000 年代初期，科罗拉多大学博尔德分校的研究人员在转基因小鼠中成功验证了该方法，而来自俄罗斯圣彼得堡奥特妇产科研究所的一个小组也使用突变的抑制 tRNA 在肌肉萎缩症小鼠模型中实现了低水平的疾病矫正。但根据奥特研究所研究人员 Anton Kiselev 的说法，其他治疗策略——包括基因替代和通读药物——当时在小鼠身上产生了更好的结果。于是，他的团队和该领域的大多数其他人一样，放弃了对tRNA 疗法的探索。自此，tRNA 疗法的研究进展一直停滞不前， 学术和工业界缺乏对抑制性 tRNA 疗法的兴趣和投资， 这种情况直到最近才得到转变。随着RNA疗法的兴起，几家初创公司，如Tevard Biosciences、Shape Therapeutics 和 ReCode Therapeutics，开始研发基于抑制性 tRNA的疗法，而更多的学术和行业团体也开始对 tRNA 重提兴趣。这其中部分原因来自于该技术具有潜在的多功能性和相较于DNA疗法的优势。

长期以来，领域内一直专注于通过替换或修改 DNA 来治愈遗传疾病。基因疗法（使用工程病毒将新的 DNA 片段输送到某人的细胞中）和基因编辑（使用 CRISPR 等系统来改变或替换现有 DNA）都有望在遗传疾病的治疗方面取得巨大进展。但这两种技术都不是万能的。以Tevard Biosciences关注的Dravet 综合征为例（Tevard的首席执行官 Daniel Fischer 和董事会主席 Warren Lammert的女儿都患有 Dravet 综合征，两人出于“逆转” Dravet 综合征的愿望创办了这家公司），Tevard关注的Dravet 综合征由SCN1A（编码关键钠通道的基因）的杂合功能丧失突变引起。SCN1A的调控受到严格调控，而传统的基因疗法可能导致过量蛋白质的生成造成危险。即使基因疗法可以达到适当的平衡，也存在一个更直接的挑战：编码SCN1A的DNA太大而无法包装到目前用于提供基因治疗的工程病毒中。这种包装问题适用于许多其他罕见疾病背后的错误基因，如囊性纤维化和肌营养不良症。同样，以CRISPR为基础的基因编辑也具有类似的包装尺寸限制，并存在对 DNA 进行永久性更改的风险。为了开展其抑制 tRNA 计划，Tevard 获得了Christopher Ahern和John Lueck 的知识产权——一个包含数百个反密码子编辑的 tRNA（称为 ACE-tRNA）的库，其中包含的每个tRNA都能够抑制提前终止密码子并掺入所需的氨基酸。

随着投资者越来越关注基因治疗和基因编辑的潜在局限性，不影响 DNA 及其精细调控的tRNA技术开始开辟出一个新的市场。与Tevard类似，由加利福尼亚大学圣地亚哥分校的Prashant Mali教授成立的Shape Therapeutics，目前也正在开发的一种新型的抑制 tRNA疗法，用于治疗由 MECP2 基因无义突变引起的神经发育障碍 Rett 综合征(其大约30%的病例由提前终止密码子引起的)。与此同时，德克萨斯 A&M 大学和德克萨斯大学西南医学中心的几位科学家也成立了ReCode Therapeutics，通过开发抑制 tRNA 疗法，用于治疗由提前终止密码子引起的囊性纤维化。随着学术与业界对tRNA疗法的应用及其优势的兴趣攀升，不少华人科学家也开始了对tRNA疗法的探索。例如，北京大学药学院的夏青教授创办了启夏解码（QiXia Decode Therapeutics），正在专注于利用工程化tRNA–酶（tRNA–enzyme pairs）治疗无义突变引起的肌肉营养不良和癌症。而来自麻省大学的T.H.Chan医学院的高光坪和王丹教授，也于2022年3月在Nature杂志上报道了首次研发重组腺相关病毒（rAAV）体内递送无义突变抑制性tRNA治疗平台（AAV-NoSTOP）的研究，为抑制性tRNA在基因治疗药物中的应用策略，提供了极大的理论和实验支持。

Table 1. 正在研发tRNA疗法的中美公司。

虽然很有希望，但抑制性tRNA 疗法还有很多不确定性。对于任何 RNA分子来说，药物递送仍然是一个挑战。其次，开发人员需要证明他们的抑制性 tRNA不会干扰正常基因的表达并刺激核糖体产生潜在的有毒蛋白质。长期以来，安全问题一直是开发抑制性 tRNA 的考虑因素。由于在各种遗传疾病中发现的提前终止密码子与细胞内正常终止密码子相同，科学家们不确定抑制型 tRNA 是否只会与它们的预期目标（那些过早的终止密码子）配对，或者它们是否也可能与正常的终止密码子结合，从而干预其他正常的蛋白质合成。这些疑问一定程度上可以通过一种称为核糖体分析（ribosome profiling）的技术得以解答。通过对抑制性 tRNA 进行核糖体分析，Ahern等研究人员发现其设计的大多数ACE-tRNA分子并没有导致比正常情况更多地忽略终止密码子。虽然并不完全理解为什么抑制型 tRNA 似乎偏爱过早终止密码子，但这项发现无疑为该技术提供了重要的理论支持和卖点。

然而，这并不意味着公司可以保证抑制 tRNA 的安全性，而针对tRNA的工程改造，或许可以帮助缓解一些tRNA的安全问题。例如，汉堡大学的 tRNA 科学家 Zoya Ignatova通过改变 tRNA 反密码子环的大小，使分子优先与过早终止密码子结合，而不是常规终止密码子。她正在申请的这项技术专利已转让给 mRNA 治疗公司 Arcturus Therapeutics。与此同时，修补 tRNA 结构的其他部分也可能有助于使这些分子成为更好的药物。

安全性并不是 tRNA 领域唯一的未知数，如何将tRNA药物成功递送进入体内，也是该领域的一大重要挑战。Shape 和 Tevard 都在使用 AAV 将抑制 tRNA的基因传递到细胞中，这种方法基本上创造了一种一次性的基因疗法。当病毒进入细胞时，一条用于合成抑制性 tRNA的 DNA 编码指令将赋予它们维持稳定且长久供应这些 tRNA 的能力。与此同时，ReCode正在使用德克萨斯大学西南医学中心化学家 Daniel Siegwart 的技术，将其化学合成的 tRNA包装成专有的脂质纳米颗粒。其研究团队认为，与使用 AAV 相比，使用脂质纳米颗粒可以有效调整剂量，从而更好地控制药物。这两种递送系统都各有优劣，而最好的系统可能取决于公司想要在哪里提供他们的tRNA。

tRNA领域的第三个未知数是tRNA作为一项新生技术，是否会被现有方法或其他尚未出现的方法替代。例如，Shape 正在开发一种用于编辑RNA的腺苷脱氨酶（ADAR）技术来纠正 mRNA 的突变。ReCode正在开发mRNA疗法，以替代囊性纤维化中的破坏基因，而在最近比较了其抑制tRNA和mRNA方法后，ReCode表示将优先考虑mRNA治疗囊性纤维化。

截至目前，还没有tRNA疗法进入临床试验。作为一项新兴的RNA技术，tRNA疗法还处于开发初期，其相较于现有的小分子通读药物、基因替代或基因编辑疗法，是否具有更大的优势，目前还不得而知。可以肯定的是，目前的tRNA疗法与其他的基因和RNA疗法一样，面临安全性和药物递送方面的一系列挑战。而随着越来越多的学术和行业团队对tRNA疗法的研究探索，如果其在安全性和有效性上得到验证，无疑将为基因治疗打开一扇全新的大门。

参考资料：

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Wang, J., Zhang, Y., Mendonca, C. A., Yukselen, O., Muneeruddin, K., Ren, L., Liang, J., Zhou, C., Xie, J., Li, J., Jiang, Z., Kucukural, A., Shaffer, S. A., Gao, G., & Wang, D. (2022). AAV-delivered suppressor tRNA overcomes a nonsense mutation in mice. Nature, 604(7905), 343–348. https://doi.org/10.1038/s41586-022-04533-3

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