体内CRISPR疗法进展、挑战与解决策略

CRISPR基因编辑技术自20世纪90年代初发现以来快速发展，发展方向主要分为体外基因编辑和体内基因编辑。目前，在这两个领域均已有候选产品进入临床试验阶段。其中国外的进展较快，国内整体处于临床前和临床早期阶段。

Editas: EDIT-101、EDIT-103

EDIT-101是一种体内基因编辑疗法。通过AAV5载体将编码Cas9核酸酶变体SaCas9的基因和两个指导RNA（gRNA）递送到感光细胞中，用于治疗Leber先天性黑蒙10型（LCA10）。2022年11月，Editas公布了EDIT-101的1/2期临床试验数据：14名接受治疗的患者有3名达到了预期。

EDIT-103 是一种不依赖于突变的CRISPR/Cas9的体内基因编辑疗法，其利用双AAV5载体递送，旨在敲除和替换视紫红质基因中的突变以保持感光器功能， 用于治疗视紫红质相关的常染色体显性视网膜色素变性 (RHO-adRP)，该候选药物有望解决150多种可导致RHO adRP病的RHO功能获得型的突变。其临床前数据显示：EDIT-103的敲除内源性RHO的能力近100%，在动物实验中，其替代RHO基因产生的蛋白质水平超过正常RHO基因产生蛋白质的30%以上。

Intellia：NTLA-2001、NTLA-2002

NTLA-2001是一款在研体内基因编辑疗法，通过脂质纳米粒子（LNP）递送技术将靶向TTR基因的CRISPR/Cas9组合递送到肝脏，实现对肝细胞内的突变甲状腺素运载蛋白（TTR）基因特定DNA片段实施敲除编辑。这也是首款进入临床试验的全身性给药CRISPR基因编辑疗法。2022年11月在美国心脏协会科学年会上公布的数据显示，所有患者在单次静脉注射NTLA-2001后28天的血清TTR降低≥90%。药物整体耐受性良好。

NTLA-2002是另一款在研全身性给药体内基因编辑疗法，旨在通过LNP递送CRISPR/Cas9系统，对激肽释放酶B1基因（KLKB1）进行编辑，从而特异性关闭KLKB1基因的表达，拟用于治疗遗传性血管水肿（HAE）。其最新1/2期临床试验数据显示：接受NTLA-2002治疗的HAE成人病患血浆激肽水平大幅度下降且HAE发作次数降低。

近日，Intellia公司也发布了2023年-2024年的战略计划，其重点推动CRISPR候选药物的后期开发，包括启动NTLA-2001和NTLA-2002的全球关键性试验。

Verve Therapeutics：VERVE-101、VERVE-201

VERVE-101是一种针对杂合子家族性高胆固醇血症（HeFH）患者的在研药物，该药由一个信使RNA和一个引导RNA组成，利用LNP靶向肝脏，对PCSK9基因的特定位点进行单个A-G碱基改变，以破坏PCSK9蛋白的产生，从而降低血液中的低密度脂蛋白胆固醇水平。临床前试验显示，接受1.5mg/kg剂量治疗的猴子在476天后，血液中PCSK9蛋白平均减少83%。

2022年12月，FDA已正式解除对其碱基编辑药物VERVE-101的临床搁置，并要求提供额外的安全信息。目前处于临床1期试验阶段。

VERVE-201是一款体内单碱基编辑基因疗法，靶向肝脏中胆固醇和甘油三酯代谢的关键调节因子ANGPTL3，能够永久性关闭ANGPTL3的表达，以治疗动脉粥样硬化性心血管疾病。

Beam Therapeutics：BEAM-301

BEAM-301是Beam首个体内碱基编辑疗法，利用LNP将碱基编辑组件以mRNA的形式递送到肝脏，修复G6PC基因的R83C点突变，以治疗糖原贮积病Ia型（GSDIa）患者。

据公司2023年1月发布的总结来看，BEAM-301的IND支持研究仍在继续，预计将在2023年年底或2024年年初提交IND申请。

体内CRISPR疗法挑战

相较于体外基因编辑而言，体内CRISPR疗法覆盖适应症广、应用场景多、想象空间大，是“兵家必争之地”。但同时，体内CRISPR疗法门槛也比较高，当下存在着诸多挑战有待解决。

递送技术

诺奖得主Jennifer曾感慨“递送技术仍可能是基因编辑疗法最大的瓶颈”。高效、安全的递送系统是体内CRISPR疗法的核心，理想的递送系统具有以下特征：在进入目的细胞前保证目的基因不会被破坏，靶向性精确，能够将转载的基因准确释放，不会引发额外的安全性问题。

目前主要用于递送的包括AAV、LNP、病毒样颗粒（VLP）递送。其中AAV是应用最为广泛的病毒载体，安全性较好，但同时也存在载量小、天然AAV靶向性弱、存在中和抗体等问题，且无法控制其在转导细胞中的表达时间，这会增加安全分析。当下不少企业改进了AAV衣壳，或者利用双AAV递送，同时CDMO企业也研发了一系列专有的改进技术，或许寻找CDMO给出一个给行的方案能够大大节省企业在这一方面的时间和精力。

LNP是体内基因编辑药物最重要的非病毒载体之一，通常由阳离子或可电离脂质、辅助脂质、聚乙二醇（PEG）、脂质和胆固醇组成。由于LNP会在肝脏细胞中聚集，故多用于肝靶向治疗。在用于非肝脏靶向时往往会采取局部注射的方式代替传统的静脉注射。此外还有诸多修饰的技术，如Siegwart等人通过加入一种带电脂质组分调节纳米粒子的内部电荷而开发出了选择性器官靶向的LNP。Epstein研究人员通过将抗CD5抗体结合到LNP表面可以实现靶向T细胞。

去年，Nature Biomedical Engineering曾报道过我国研究人员蔡宇伽团队发明了一种介于病毒载体与非病毒载体之间的类病毒体递送技术（VLP），能够递送CRISPR/Cas9 mRNA，实现安全和高效的体内基因编辑。

此外，除了递送技术，大规模的递送载体生产也是需要解决的挑战，保障批次间的稳定性和工艺的可放大性也是创新药企在开发体内基因疗法所需要提前考虑的因素。

脱靶问题

在体外基因编辑中，研究人员可以利用特定的技术识别脱靶细胞，而在体内基因编辑中脱靶风险的控制难度更高。同时基因编辑工具在体内长时间表达有可能导致脱靶效应累积，也有可能诱导免疫系统的排斥反应。基于此，研究人员研发了mRNA瞬时表达CRISPR基因编辑工具的疗法，降低了长时间表达带来的脱靶风险。

另外，还可以通过提高sgRNA特异性、控制Cas9-sgRNA用量、改造Cas9等方法从源头降低脱靶问题。通常将sgRNA靠近PAM的10-12 bp的碱基对称为种子区，它决定sgRNA与靶点识别的特异性，研究发现当PAM远端第15个碱基为胞嘧啶时，可增加sgRNA的特异性，降低脱靶。通过Cas9蛋白的封闭抗体或抑制剂来降低Cas9活性，降低脱靶效应，然而通过调节sgRNA和Cas9核酸酶的浓度也会相应地改变基因组编辑能力，因此必须考虑基因编辑效率与脱靶效应之间的平衡。此外，利用脱靶检测方法也可以有效地起到把关作用。

安全性问题

CRISPR的安全性尚需更多的临床数据证明，除了脱靶问题带来脱靶毒性外，CRISPR还有可能带来非预期效果，如诱导产生双链断裂，触发细胞凋亡，以及免疫原性。在编辑人类多能干细胞时，CRISPR可能会诱导双链DNA断裂，激活p53引发细胞凋亡而降低编辑作用。

另一篇题为“CRISPR-Cas9 induces large structural variants at on-targetand off-target sites in vivo that segregate across generations”的文章发现CRISPR-Cas9基因组编辑会导致DNA发生不可预见的结构突变，且可以传递给下一代。针对这些问题，科学家对Cas9蛋白进行了突变筛选，部分Cas变体只引发单链断裂。目前，碱基编辑和先导编辑的发展也一定程度上提高了安全性。

监管问题

CRISPR技术能够永久性改变遗传物质，所产生的潜在影响或许在当下的无法完全认知。而随着越来越多的CRISPR候选产品进入临床乃至未来申请上市，其监管方面也面临着挑战。与此前首款细胞疗法上市相似，CRISPR领域也是“史无前例”，需要从0到1逐步建立从顶层设计到具体药物研发、生产、上市等各个环节的全方位监管政策。

在2022年5月，CDE发布的《体内基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》中有7处直接提到CRISPR-Cas，其中提到“对于基于 CRISPR-Cas的基因治疗产品，建议采用多种方法对编辑系统的风险进行全面的分析和评估。例如，编辑系统自身特定的局限性，序列靶向的特异性，脱靶位点的分析，编辑酶的精准度（fidelity）和编辑效率，编辑系统的生产和质量控制，编辑技术对细胞促瘤/成瘤的优势筛选，编辑系统组分的免疫原性，编辑工具相关序列的非特异性插入，多靶点编辑的基因组重排，基因组突变等。

此外还有《体外基因修饰系统药学研究与评价技术指导原则（试行）》的通告（2022年第29号）等文件都对国内CRISPR技术的发展起到一定规范和指导作用。但从整个行业而言，监管还有很长的路要走。

总结

目前CRISPR基因编辑技术仍处于高速发展阶段，且当下行业尚不成熟。相信未来在技术的推动下，更多递送技术将会被优化，新的递送工具也将会出现，安全性和疗效将会得到进一步提升。离体的CRISPR基因编辑技术即将上市，相信体内的也会在5-10年内问世。

参考资料：

1.企业官网

2.http://www.pibb.ac.cn/html/2018/8/20180013.htm

转自：医麦客 2023-01-27