科研丨中科院上海药物所: 罗伊氏乳杆菌和咖啡酰奎宁酸协同促进脂肪褐变并改善肥胖相关疾病(国人佳作)

编译：微科盟yl，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读  

大量摄入富含咖啡酰奎宁酸(CQA)的膳食补充剂，如绿咖啡豆提取物，具有促进健康和维持代谢稳态的作用。与许多具有高药理活性但生物利用度低的活性草药成分类似，报道称CQA是一种具有抗肥胖特性的有前景的产热剂，而其口服吸收较差。肠道是CQA暴露的第一个部位，肠道微生物对CQA反应迅速。因此，探索肠道微生物组和微生物代谢物在CQA对肥胖相关疾病的有益影响中的作用是有意义的。结果表明，口服CQA补充剂通过激活脂肪褐变有效增加能量消耗，从而改善高脂肪饮食诱导的肥胖(DIO)小鼠中肥胖相关代谢功能障碍。通过16S rRNA基因扩增子测序显示，CQA治疗重塑了肠道微生物群以促进其抗肥胖作用，抗生素治疗和粪便微生物群移植证实了这一点。CQA富集了肠道共生物种L. reuteri，并刺激了短链脂肪酸的产生，特别是丙酸盐。L. reuteri的单定植或低剂量CQA治疗并未减轻DIO小鼠的肥胖，而它们的组合引起了增强的产热反应，表明CQA和L. reuteri对肥胖的协同作用。外源性丙酸盐补充模拟了CQA单独或与L. reuteri联合使用的抗肥胖作用。本研究的数据表明，L. reuteri、丙酸盐和米色脂肪组织在CQA通过调节产热而发挥抗肥胖作用中存在功能轴。这些结果为生物利用度差的草药成分通过与肠道微生物群的相互作用进行治疗提供了机制见解。  

论文ID

原名：Limosilactobacillus reuteri and caffeoylquinic acid synergistically promote adipose browning and ameliorate obesity-associated disorders

译名：罗伊氏乳杆菌和咖啡酰奎宁酸协同促进脂肪褐变并改善肥胖相关疾病

期刊：Microbiome

IF：16.837

发表时间：2022.12

通讯作者：谢岑

通讯作者单位：中国科学院上海药物研究所

DOI号：10.1186/s40168-022-01430-9

实验设计

结果

1 CQA治疗保护小鼠免受饮食诱导的肥胖并促进能量消耗

与先前的报道一致，CQA治疗(HFD-CQA;每日150mg/kg)可显著防止DIO小鼠体重增加(图1a)。与对照组(HFD-V)小鼠相比，HFD-CQA组的脂肪量和肥/瘦指数显著降低，而瘦体重不受影响(图1b-d)。为了阐明CQA在肥胖相关胰岛素抵抗中的作用，进行了葡萄糖耐量试验(GTT)和胰岛素耐量试验(ITT)，发现CQA处理改善了葡萄糖耐量并增加了胰岛素敏感性(图1e，f)。HFD-CQA小鼠的空腹血糖、胰岛素和HOMA-IR指数低于HFD-V小鼠，这进一步证实了CQA治疗对胰岛素抵抗的改善(图1g-i)。此外，HFD-CQA小鼠的血清甘油三酯、总胆固醇(T-CHO)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平低于HFD-V小鼠，但高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的水平没有降低，表明血脂减轻(图1j-m)。肝脏重量、肝脏甘油三酯和T-CHO(图1n-p)的降低，以及脂肪肝的改善(图1q)，表明CQA也缓解了肝脂肪变性。该数据与肝脏中血清游离脂肪酸(FFA)水平降低和脂肪生成相关基因mRNA表达降低相一致。棕榈油酸与棕榈酸酯(16:1/16:0)和硬脂酸酯与油酸酯比值(18:1/18:0)降低，以及肝脏中硬脂酰辅酶A去饱和酶(Scd1)的mRNA表达降低，表明肥胖有所改善。综上所述，这些结果表明，口服CQA可预防肥胖以及摄入HFD后预防相关的葡萄糖和脂质失调。

图1. CQA减轻了高脂肪饮食(HFD)诱导的小鼠肥胖(DIO)和代谢紊乱。

给小鼠喂食HFD 8周，然后每天用赋形剂或CQA(150 mg/kg)口服治疗持续8周。a，体重。b，瘦体重。c，脂肪质量。d，脂肪/瘦指数。e，葡萄糖耐量试验(GTT)和曲线下面积(AUC)。f，胰岛素耐量试验和AUC。g，空腹血糖。h，空腹胰岛素。i，胰岛素抵抗指数。j，血清甘油三酯。k，血清总胆固醇。l，血清高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)。m，血清低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。n，肝脏重量。o，肝甘油三酯。p，肝脏T-CHO。q，肝切片的代表性H&E染色(上)和油红O染色(下)图像，比例尺：50 μm。脂质用油红O染色为阳性(红色)，并通过图像J软件定量。

CQA处理小鼠的代谢改善不是由于热量摄入减少或诱导活动(图2a，b)，而是能量代谢增强的结果。HFD-CQA小鼠在冷暴露后保持较高的体温(图2f)，表明CQA处理的小鼠通过燃烧脂肪组织保持增强的适应性非寒颤产热。为了确认CQA对能量消耗的影响，我们对小鼠进行了间接量热分析。正如预期的那样，HFD-CQA小鼠消耗了更多的O2，释放更多的CO2，从而大大促进了能量消耗(图2c)。此外，我们调整了体重和成分不同的两组小鼠的代谢率(MR)，观察到CQA处理组小鼠落在单独的回归线上，显著增加了预测MR，表明CQA对产热的机械效应(图2d，e)。此外，CQA处理显著诱导脂肪组织中产热相关基因的mRNA表达，特别是在iWAT和BAT中，但在内脏附睾WAT(eWAT)中没有(图2g)。与此一致，CQA处理也增加了iWAT和BAT中的UCP1蛋白水平(图2h)。此外，我们进一步使用UCP1敲除(UCP1 KO)小鼠来评估UCP1依赖性产热在CQA抗肥胖作用中的贡献(图2i)。与野生型对照(WT-V)小鼠相比，CQA处理的野生型(WT-CQA)小鼠的治疗效果(包括体重控制和能量消耗)显著提高。然而，给药CQA对UCP1 KO小鼠没有抗肥胖作用(图2j-m)。这些结果支持CQA可以刺激UCP1依赖性产热促进代谢。

图2. CQA增强肥胖小鼠的能量消耗。

给小鼠喂食HFD 8周，然后每天用赋形剂或CQA(150 mg/kg)口服治疗持续8周。a，每日食物摄入量。b，总活动量。c，VO2、VCO2和呼吸交换比(RER)。d、e，光照(d)或黑暗(e)下的预测代谢率(MR)。f，核心温度。g，脂肪组织中产热基因的相对mRNA表达。h，iWAT切片(上)和BAT切片(下)的代表性UCP1染色，比例尺：50 μm。将UCP1敲除(UCP1 KO)小鼠和对照野生型(WT)小鼠喂食HFD 4周，然后用赋形剂或CQA(150 mg/kg)灌胃4周。i，处理示意图。j，体重。k，室温下的核心温度。l，iWAT和BAT中产热基因的mRNA表达。m，iWAT切片(上)和BAT切片(下)的代表性H&E染色，比例尺：50 μm。数据以平均值 ± SD表示，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，ns不显著。

2 CQA的抗肥胖作用依赖于肠道菌群

CQA是一种生物利用度低的极性化合物。先前发现CQA可以被人类肠道细菌水解为咖啡酸(CA)，我们也发现血清CQA水平相对于其高给药剂量(150 mg/kg)非常低。但出乎意料的是，在HFD-CQA小鼠的血清中几乎检测不到CA。因此，可以合理地假设CQA可能通过与肠道微生物群相互作用间接影响产热。为了确定肠道微生物群是否参与CQA的抗肥胖作用，我们通过在DIO小鼠饮用水中加入抗生素混合物，以清除大部分肠道微生物群，清除结果得到扩增子测序数据的支持。正如预期的那样，CQA的治疗效果在抗生素干预后消失(图3a-f)。应该注意的是，CQA处理的微生物群减少(HFD-CQA-Abs)小鼠在冷暴露后仍保持相对较高的体温，且BAT中UCP1的表达较高，但无统计学意义(图3g，h，j)。然而，经CQA处理后iWAT的褐变现象在抗生素干预后消失(图3h，i)。这些结果表明，iWAT可能是CQA通过调节肠道微生物群来增强产热和改善全身代谢的主要靶组织，而BAT中UCP1的上调不太可能受到微生物调节途径的控制。

为了进一步阐明肠道菌群在介导CQA对代谢性疾病的有益影响中的致病作用，我们将对照或CQA处理小鼠的粪便微生物群移植到受体小鼠中持续8周，以确保其植入供体微生物组。我们进行了16S rRNA测序分析，并比较了供体组(HFD-V和HFD-CQA)以及受体组(rHFD-V和rHFD-CQA)之间的肠道微生物群。在PCA图中，两个供体组被第一组分(PCA1)明确分开。FMT后，两个受体组也被PCA1分开，rHFD-V组的分布更接近HFD-V组，而rHFD-CQA组的分布更接近HFD-CQA组，表明FMT在受体小鼠中成功。与对照菌群移植(rHFD-V)小鼠相比，CQA菌群移植(rHFD-CQA)确实复现了CQA处理对代谢功能障碍的影响。与体重控制一致(图3k)，在接受CQA处理的微生物群后，小鼠葡萄糖和脂质代谢的能力表现出明显的改善(图3l-n)。此外，rHFD-CQA小鼠肝脏脂肪生成和脂质积累显著降低(图3o，p)。此外，与rHFD-V小鼠相比，rHFD-CQA小鼠在冷胁迫下通过iWAT褐变更能抵抗体温损失，而不会显著影响BAT中的UCP1表达(图3q，r)。同时，冷胁迫的rHFD-CQA小鼠仅在iWAT中显示出UCP1蛋白水平显著增加(图3s)，这与抗生素研究的结果一致，即只有iWAT中UCP1表达的差异因抗生素诱导的微生物群消耗而减少。因此，微生物群耗竭和FMT实验都支持肠道微生物群在CQA的抗肥胖作用中发挥作用的观点，并且来自CQA处理的DIO小鼠的FMT足以通过促进iWAT褐变来增加能量代谢，从而改善系统代谢。

图3. 肠道微生物群介导CQA治疗的疗效。

小鼠喂食HFD 8周，然后在饮用水中用赋形剂或CQA(150 mg/kg)与抗生素混合物灌胃8周。a，微生物群减少小鼠的体重。b，脂肪质量。c，GTT和AUC。d，肝脏甘油三酯。e，肝脏T-CHO。f，肝脏脂质合成相关基因的mRNA表达。g，核心温度。h，iWAT和BAT中产热基因的相对mRNA表达。i–j，iWAT切片(i)和BAT切片(j)的代表性UCP1染色图像，比例尺：50 μm。给小鼠喂食HFD 8周，然后作为受体小鼠接受赋形剂处理或CQA处理的DIO小鼠的粪便微生物群治疗8周，每周两次。k，粪便微生物群移植(FMT)小鼠的体重。(l) GTT和AUC。m，肝脏甘油三酯。n，肝脏T-CHO。o，肝脏脂质合成相关基因的mRNA表达。p，肝脏切片的代表性H&E染色(上)和油红O染色(下)图像，比例尺：50 μm。q，FMT小鼠的核心温度。r，FMT小鼠iWAT和BAT中产热基因的相对mRNA表达。s，iWAT切片(上)和BAT切片(下)的代表性UCP1染色，比例尺：50 μm。数据以平均值 ± SD表示，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，ns不显著。

3 CQA逆转了肥胖引起的肠道生态失调，并富集了乳酸产生菌

接下来，我们通过16S rRNA基因扩增子测序研究了CQA如何影响肠道微生物群结构。与未经处理的DIO小鼠相比，CQA没有改变肠道菌群的α多样性(图4a)，而HFD-V和HFD-CQA之间的肠道微生物群的整体结构不同(图4b)。门水平的分类分析显示，CQA处理后无显著差异(图4c)。在DIO小鼠中相对丰度大于0.1%的前35个最丰富的物种中，产乳酸细菌(LAB)，特别是罗伊氏乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)和乳酸乳球菌(L.lactis)，在CQA处理后显著富集(图4d-g)。产热随着LAB的富集而增强(图4h)。同样，我们也发现在FMT之后，rHFD-CQA组L. reuteri的丰度增加。为了确定哪些LAB物种对CQA处理有特异性反应，我们用CQA体外培养小鼠微生物群和单一菌株。在DIO小鼠粪便微生物群厌氧培养中， CQA有助于L. reuteri的生长，而乳酸乳球菌对CQA没有反应(图4i)。CQA还刺激了单独培养的L. reuteri (ATCC 23，272)和乳酸乳球菌(ATCC 19，435)的生长(图4j)。因此，本研究的结果表明，CQA显著改变了盲肠菌群组成，L. reuteri大量富集。然而，L. reuteri不能将CQA水解为CA，这表明CQA促进L. reuteri生长并不是由微生物对CQA的代谢直接引起的。

图4. CQA改变肠道微生物群组成，特别是在乳酸菌富集方面。

a，基于 Shannon 指数和 Simpson 指数的α多样性分析。b，主成分分析。c，门水平的细菌分类学分析。d，细菌分类群的热图。e、f，通过测序分析检测到的粪便中 Limosilactobacillus reuteri (%)(e)和 L. lactis (%)(f)的相对丰度。g，LEfSe分析确定的两组之间的鉴别性分类群(log10 LDA>4)。h， L. reuteri (%)和 L. lactis 丰度(%)与产热性状的相关性。i， L. reuteri 和 L. lactis 在DIO小鼠粪便微生物群厌氧培养中的相对丰度。j， L. reuteri 和 L. lactis的OD600。 数据以平均值   ±   SD表示，*p   <   0.05，**p   <   0.01，***p   <   0.001，ns不显著。

接下来，我们从长期HFD-CQA组中选择了六只小鼠(图1)，并将体重增加最多的三只小鼠指定为无应答小鼠，将体重增加最少的三只小鼠指定为应答者。与无应答者相比，CQA治疗在应答者的体重控制方面表现出更好的改善。应答者的脂肪/瘦指数水平和血清LDL-C水平低于无应答者。然而，其他参数，如空腹血糖、血清甘油三酯和血清T-CHO的变化倾向于无显著差异，这可能是由于样本数量不足。有趣的是，响应CQA的微生物，L. reuteri而不是乳酸乳球菌在应答者中高度富集。

为了验证L. reuteri在CQA调节作用中的作用，本研究通过操纵DIO小鼠肠道微生物群的组成，然后给小鼠注射了CQA。在体外培养中，我们筛选分析L. reuteri对抗生素混合物和其他常见抗生素成分的敏感性，L. reuteri对混合物中的成分更敏感，尤其是杆菌肽，但不受万古霉素的影响。因此，杆菌肽和万古霉素用于选择性干扰L. reuteri，从而产生缺乏(杆菌肽处理)或富集(万古霉素处理) L. reuteri的小鼠(图5a)。结果显示，CQA仍然减缓万古霉素处理(Van-CQA)小鼠的体重增加，并减轻血脂异常和肝脂肪变性，但在杆菌肽处理(Bac-CQA)小鼠中则没有这种效果(图5b-f)，表明CQA改善肥胖相关疾病的作用可能需要L. reuteri的存在。此外，Veh-CQA小鼠和Van-CQA小鼠更能抵抗寒冷诱导的体温丧失，同时iWAT中UCP1表达上调(图5g-i)，这在Bac-CQA组中未观察到。结果表明，杆菌肽处理后L. reuteri的缺乏可能抵消了CQA对产热的影响。

由于除L. reuteri外，杆菌肽和万古霉素都强烈影响肠道微生物群的整体结构，因此我们通过使用由六种细菌菌株组成的简化微生物群落进一步评估了L. reuteri在调节CQA效果中的作用(图5j)。在CQA处理前，我们用含有L. reuteri(群落1)或不含L. reuteri(群落2)的微生物群落定植抗生素处理的DIO小鼠1周。与群落2定植小鼠相比，CQA处理对代谢功能障碍的积极作用在群落1定植小鼠中得到了复制(图5k-o)。因此，选择性微生物群耗竭和定制微生物群落定植都支持L. reuteri在CQA的抗肥胖作用中发挥作用的观点，特别是在与产热和能量代谢相关的功能中。

图5. 缺乏或含有L. reuteri微生物群落的小鼠干预影响CQA的抗肥胖表型。

给小鼠喂食HFD 10周，然后用赋形剂或CQA(150 mg/kg)与选择性抗生素一起灌胃4周。a，选择性抗生素补充剂与CQA联合使用的示意图。b，体重。c，血清甘油三酯。d，血清T-CHO。e，肝甘油三酯。f，肝脏T-CHO。g，核心温度。h，iWAT中产热基因的相对mRNA表达。i，iWAT切片的代表性UCP1染色图像，比例尺：50 μm。给小鼠喂食HFD 10周，然后用赋形剂或CQA(150 mg/kg)以及确定的微生物一起灌胃4周。j，各实验组确定的微生物群组成。k，体重。l，血清甘油三酯。m，血清T-CHO。n，肝甘油三酯。o，肝脏T-CHO。p，核心温度。q，iWAT中产热基因的相对mRNA表达。r，iWAT切片的代表性UCP1染色图像，比例尺：50 μm。数据以平均值 ± SD表示，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，ns不显著。  

4 L. reuteri与低剂量CQA协同治疗肥胖及相关代谢功能障碍

LAB作为人肠道革兰氏阳性共生菌已被广泛研究。LAB作为益生菌的药理学重要性体现在它们对动物和宿主免疫健康微生态的普遍贡献上。为了验证L. reuteri或乳酸乳球菌定植可能在肥胖相关疾病中表现出有益作用，DIO小鼠每周口服两次L. reuteri或乳酸乳球菌或生理盐水，持续8周。出乎意料的是，用L. reuteri处理的DIO小鼠未能产生CQA治疗中观察到的抗肥胖作用，而乳酸乳球菌处理可显著预防肥胖及相关症状。综上所述，这些数据表明乳酸乳球菌是治疗肥胖相关功能障碍的潜在益生菌，而L. reuteri没有直接影响。

这些结果促使我们确定L. reuteri和CQA联合治疗DIO小鼠的潜在疗效，因为CQA可能支持L. reuteri的生长和/或代谢。为了尽量减少CQA引起的抗肥胖作用，将给药方案从每日给药调整为每周两次给药，CQA剂量从150 mg/kg降至50 mg/kg(图6a)。单次给药低剂量CQA和L. reuteri对代谢参数均无显著的治疗效果(图6b-m)。相比之下，与对照组(HFD-V)组和单一治疗组相比，联合治疗显著降低了体重增加(图6b)，而不影响食物摄入量(图6c)。因此，与单独处理相比，L. reuteri+CQA处理小鼠的脂肪指数(图6d)、葡萄糖代谢(图6e)以及与脂质代谢相关的血清和肝脏生化参数(图6f-i)均显著改善。此外，油红O染色的肝脏切片形态学和肝脏脂质代谢相关基因mRNA表达结果(图6j)共同表明，L. reuteri+CQA联合治疗减轻了肝脂肪变性。值得注意的是，联合治疗显著增加了冷暴露后核心温度升高的能量消耗(图6k)。此外，我们发现联合治疗主要通过iWAT和BAT的褐变促进产热，如产热相关基因Ucp1和Pgc1α的mRNA水平增加以及明显的褐变形态(图6l，m)。总体而言，这些数据表明，L. reuteri和CQA联合治疗表现出比单独治疗更好的抗肥胖反应。我们假设CQA除了生长刺激外，还可能影响L. reuteri的代谢，产生有助于CQA对肥胖发挥有益作用的代谢物。

图6. L. reuteri改善CQA治疗的DIO小鼠的代谢紊乱。

HFD喂养的小鼠每周两次灌胃L. reuteri+CQA(1×108 CFU细菌，50 mg/kg CQA)，连续5周。a，L. reuteri补充剂与CQA联合使用的示意图。b，体重变化。c，每日食物摄入量。d，脂肪指数。e，ITT和AUC。f，血清甘油三酯。g，血清T-CHO。h，肝甘油三酯。i，肝脏T-CHO。j，肝脏切片油红O染色的代表性图像，比例尺：50 μm。k，核心温度。l，iWAT中产热基因的相对mRNA表达。m，iWAT切片的代表性UCP1染色图像，比例尺：50 μm。数据以平均值 ± SD表示，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，ns不显著。  

5 补充CQA可上调L. reuteri丙酸的产生

为了研究CQA诱导的肠道微生物群代谢和功能改变，通过京都基因和基因组百科全书(KEGG)数据库，使用PICRUSt来预测功能同源性。预测显示，与HFD-V组相比，CQA处理小鼠的肠道微生物组具有更高的产生乙酸盐和丙酸的潜力(图7a)，这进一步得到了CQA处理后介导乙酸和丙酸合成的必需酶K00656(甲基丙二酰辅酶A变位酶，pfld)、K13788(磷酸乙酰转移酶，pta)和K00925(乙酸激酶，acka)的相对丰度的观察结果的支持(图7b)。K13788和K00925的微生物表达在L. reuteri+CQA处理的小鼠(图7c)或L. reuteri+CQA共培养物(图7d)中也上调。这些数据表明，补充CQA可能会促使L. reuteri产生更多的SCFA，尤其是乙酸盐和丙酸盐。

SCFA是肠道微生物发酵的最终产物。许多报道发现了SCFAs和乳酸在减轻代谢性疾病方面的有益作用。为了支持上述基因表达结果并验证细菌SCFAs和乳酸是否发生了改变，进行了基于液相色谱/质谱(LC/MS)的分析，以测量不同模型中的这些微生物代谢物。正如预期的那样，用CQA长期处理后，粪便中的乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐和乳酸浓度均增加，但在抗生素干预的小鼠中则没有(图7e，g)。然而，这些观察结果与KEGG Orthology(KO)的变化并不一致，表明由于代谢环境的改善，其他产生SCFAs的微生物也得到了恢复，提示SCFAs和乳酸的改变可能是肠道失调减轻的结果。为了进一步确定哪种代谢物对CQA处理有反应，我们分别在FMT、短期L. reuteri+CQA联合治疗以及L. reuteri+CQA共培养模型中测量了SCFAs和乳酸。值得注意的是，丙酸在所有模型中都是一致且最高的升高(图7f，h，i)。此外，我们还发现所有模型中的乳酸产生均增加，这可能部分归因于CQA处理使L. reuteri富集。总之，这些结果为CQA和L. reuteri之间的相互作用提供了新的视角，表明CQA可能增强了丙酸盐生产的细菌潜力。

图7. CQA增加了DIO小鼠的粪便丙酸盐水平。

a，乙酸盐和丙酸盐的代谢途径以及相应的KO和基因。b，CQA处理小鼠的粪便KO表达。c，L. reuteri+CQA处理小鼠的粪便KO表达。d，厌氧培养中经CQA处理的L. reuteri的KO表达。e，CQA处理后粪便中乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐和乳酸水平。f，FMT处理后粪便中丙酸盐水平。g，微生物群减少小鼠粪便中的乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐水平。h，L. reuteri+CQA联合处理后盲肠内容物中丙酸盐水平。i，与CQA共培养后L. reuteri上清液中的丙酸盐水平。数据以平均值 ± SD表示，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，ns不显著。  

6 单羧酸转运蛋白1是肥胖小鼠丙酸盐诱导能量消耗所必需的

上述数据清楚地表明，CQA可以刺激L. reuteri的生长，促进丙酸盐的产生。为了进一步探索丙酸盐增加与iWAT褐变之间的因果关系，我们在饮用水中给DIO小鼠施用丙酸钠4周(图8a)。结果表明，在DIO小鼠中，补充丙酸盐(HFD-PA)产生的效果与联合使用L. reuteri和CQA(HFD-RQ)的效果相似，但不影响食欲(图8b，c)。最重要的是，丙酸盐通过促进iWAT的产热功能诱导能量消耗，这复制了L. reuteri+CQA联合处理的效果(图8d-g)。补充结果进一步表明，丙酸可能是CQA治疗选择性诱发的微生物代谢信号，是L. reuteri+CQA联合治疗具有良好抗肥胖效果的原因之一。

据报道，MCTs可驱动SCFA转运穿过脂肪细胞质膜。在四种亚型中，MCT1和MCT4负责丙酸盐转运。鉴于最近的证据表明MCT1/4的表达受能量消耗的生理刺激控制，我们发现通过补充丙酸盐或L. reuteri+CQA联合处理，MCT1蛋白水平确实在iWAT中强烈上调，而MCT4表达仅略微上调(图8h)，表明MCT1在丙酸盐诱导的产热中的潜在作用。因此，我们研究了MCT1功能的阻断是否可以消除丙酸盐或L. reuteri+CQA联合治疗对肥胖的治疗效果。施用MCT抑制剂(7ACC1)以破坏肥胖小鼠中的丙酸盐分布。结果显示，在肥胖相关的代谢紊乱中，7ACC1处理的小鼠对L. reuteri+CQA(HFD-RQi)或丙酸盐治疗(HFD-PAi)均无反应(图8b，c)。同时，7ACC1干预使耐寒性减弱和iWAT褐变，而MCT1表达的增加趋势也减弱(图8d-h)。

为了获得MCT1在丙酸盐诱导的iWAT褐变中的关键作用的更明确证据，我们通过原位注射AAV-shMct1敲低iWAT中的MCT1，然后用L. reuteri+CQA处理小鼠(图8i)。AAV-shMct1注射小鼠的iWAT中Mct1 mRNA显著下调(图8j)。与7ACC1治疗类似，MCT1敲低消除了L. reuteri+CQA联合治疗的疗效，包括体重减轻和产热增强(图8k-n)。上述结果表明，L. reuteri与低剂量CQA协同作用以产生更多的丙酸盐，从而以MCT1依赖性方式缓解肥胖相关的代谢紊乱(图8o)。

图8. 单羧酸转运蛋白1(MCT1)是参与丙酸盐诱导的能量消耗的必需转运蛋白。

用丙酸盐和/或MCT抑制剂干预HFD喂养的小鼠4周。a，补充丙酸盐和MCT抑制剂干预示意图。b，体重。c，每日食物摄入量。d、e，相对于室温的核心温度(d)和低温胁迫(e)。f，iWAT中产热基因的相对mRNA表达。g，iWAT切片的代表性UCP1染色图像，比例尺：50 μm。h，iWAT中MCT1和MCT4的蛋白表达。小鼠喂食HFD 10周，然后在AAV注射后每周两次用L. reuteri+CQA处理3周。i，实验设计和iWAT AAV注射。j，注射AAV-sh Mct1或AAV-Scramble的iWAT中Mct1的mRNA相对水平。k，体重。l，核心温度。m，iWAT中产热基因的相对mRNA表达。n，iWAT切片的代表性UCP1染色图像，比例尺：50 μm。o，咖啡酰奎宁酸(CQA)通过L. reuteri-丙酸-米色脂肪轴抗肥胖作用的拟议模型。数据以平均值 ± SD表示，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，ns不显著。  

讨论

绿咖啡豆提取物被广泛用作控制体重的膳食补充剂。超重受试者或代谢综合征患者的临床研究表明，食用绿咖啡豆提取物或CQA异构体复合物对胰岛素抵抗和腹部肥胖具有改善作用。然而，潜在的分子机制仍不清楚。本文使用150 mg/kg的CQA进行慢性治疗，50 mg/kg的CQA与微生物联合治疗，其与基于人-动物剂量转换的人类剂量相匹配，因此具有临床相关性。由于CQA肠道吸收不良，口服后其与肠道微生物群直接接触。在当前的研究中，我们证明了由CQA诱导的肠道微生物群及其代谢物(如丙酸盐)在减轻肥胖相关代谢功能障碍中发挥了重要作用。

能量稳态依赖于棕色或米色脂肪组织，这被认为是肥胖治疗的新靶点。作为产热中的重要元素，UCP1将绕过线粒体电子传递链的能量转化为增加产热。BAT和iWAT中的棕色和米色脂肪细胞被称为UCP1阳性脂肪细胞，可启动对急性冷应激的产热反应。一般来说，UCP1本质上是不活跃的，需要伴随激活来产生热量。我们的数据表明，CQA可以刺激iWAT和BAT中的UCP1上调和激活，从而产生代谢益处。此外，微生物群耗竭和FMT实验的结果支持了BAT中UCP1的上调可能与微生物调节途径无关，而iWAT是CQA通过调节肠道微生物群来增强能量消耗和改善全身代谢的主要靶组织。我们还发现，CQA上调了WT小鼠和UCP1 KO小鼠中L. reuteri的丰度，这表明UCP1是脂肪组织响应L. reuteri富集的关键下游效应物。然而，关于UCP1激活的潜在分子机制有待进一步研究。

将肠道微生物群与肥胖联系起来的确切机制尚不清楚，但许多动物和人类研究表明肠道微生物失衡与肥胖和相关代谢紊乱有关。肠道微生物群是肥胖管理的潜在目标。因此，天然产物可以作为益生元来重塑肠道微生物群，从而产生有利的代谢结果。然而，注意到对天然产物的反应一致性较差，这通常归因于肠道微生物群的巨大个体差异。在本研究中，我们证实了长期CQA治疗确实存在可能的应答/无应答效应。然而，L. reuteri+CQA联合治疗的研究结果表明，L. reuteri的定植使小鼠对CQA治疗敏感，因此，联合治疗组的应答/无应答效应明显减弱。

一些研究表明，短期使用益生菌(如LAB)治疗肥胖啮齿动物可能会产生抗肥胖作用，但由于耐受性问题，长期定植失败。在本研究开始时，我们对两种乳酸菌L. reuteri和乳酸乳球菌(L. lactis)非常感兴趣，因为它们的益生元功能得到广泛认可，并且在CQA处理的DIO小鼠肠道中富集。然而，只有乳酸乳球菌减轻了代谢功能障碍，而L. reuteri的影响可以忽略不计。这些观察结果促使我们进一步研究CQA和L. reuteri之间的相互作用。选择性微生物群耗竭和定制微生物群落定植都表明，L. reuteri在CQA的抗肥胖作用中起着至关重要的作用。此外，与其他治疗相比，补充低剂量CQA和L. reuteri作为益生元显示出额外的抗肥胖益处，从而突出了益生菌与CQA等益生元的同步应用，作为一种有前景的肠道微生物靶向代谢干预策略。值得注意的是，我们没有包括一个灭活细菌组作为对照，这是本研究的一个局限性。

越来越多的证据表明，SCFAs是厌氧微生物内源性乳酸或丙酮酸的最终发酵产物，可作为肠道微生物群与宿主代谢之间通信的强大信号传递器。在本研究中，CQA处理粪便中的KO改变与乙酸盐和丙酸盐的产生有功能上的联系。然而，无法确定每个SCFA的负责基因，特别是因为CoA转移酶往往具有广泛的底物特异性。与此一致，我们只发现丙酸盐的产生在所有实验环境中都发生了一致且最显著的变化，这表明丙酸盐可能代表了我们研究中“CQA-微生物群-宿主代谢”通讯中的关键细菌代谢物。据报道，两种广泛分布于多个器官的单羧酸转运蛋白MCT1和MCT4，可在脂肪细胞中转运丙酸盐。事实上，在L. reuteri+CQA联合治疗后，在iWAT中观察到MCT1蛋白水平上调。因此，我们进行了MCT抑制剂7ACC1治疗或iWAT Mct1敲低研究，以确定L. reuteri+CQA联合治疗的抗肥胖能力是否需要脂肪组织中的丙酸信号。两种干预措施都消除了L. reuteri+CQA联合处理诱导的产热增强。因此，本研究的结果表明L. reuteri衍生的丙酸可能通过MCT1依赖性途径起作用，从而强调了L. reuteri-丙酸-米色脂肪轴在CQA抗肥胖作用中的功能重要性。

丙酸盐对宿主代谢紊乱具有多种有益作用，例如降低血糖、减少食欲和腹部脂肪堆积、刺激肠道糖异生从而改善葡萄糖代谢、减轻全身炎症以及恢复HFD诱导的对视觉和听觉皮层之间功能连接的影响。然而，尽管实验结果表明体重控制明显，但没有观察到食欲的任何变化。这些不一致的结果可能与不同的剂量和给药途径有关。即使我们提供了相对较低剂量的丙酸盐，它仍然可以在iWAT中诱导明显的褐变并增加能量消耗，强调丙酸的直接产热潜力，以减少肥胖。

本研究存在一些局限性。首先，我们认识到CQA可以显著上调BAT的产热能力，但它似乎与微生物调节途径无关。应该注意的是，我们的研究并未排除CQA抗肥胖作用的其他机制。其次，本研究提出了一种新的治疗策略，即联合使用益生菌L. reuteri和益生元CQA治疗肥胖；然而，缺乏关于CQA如何促进L. reuteri生长并选择性上调其丙酸盐产生的分子机制的知识。第三，丙酸盐的产生是多种肠道共生菌的功能，这些共生菌在人类和小鼠的肠道中比L. reuteri更占优势，我们不能排除其他细菌在CQA的有益作用中发挥作用。尽管如此，我们证明了L. reuteri和低剂量CQA的联合治疗确实再现了CQA的最有益效果，破译了CQA至少部分通过L. reuteri-丙酸-米色脂肪轴治疗肥胖。需要更深入的研究和微生物调查来验证本研究的结果。

结论

综上所述，本研究表明，补充CQA通过调节微生物组成和诱导“无处不在”的代谢物(如丙酸)来逆转HFD诱导的肥胖，这至少是观察到的积极效果的部分原因。L. reuteri和低剂量CQA的组合对肥胖的有益效果优于单独治疗，这有助于降低CQA的剂量和给药频率，并加强我们研究的转化意义。总体而言，本研究结果描述了L. reuteri-丙酸酯-米色脂肪轴在CQA抗肥胖特性中的决定性作用，并为应用基于微生物的“益生菌-益生元”治疗策略治疗肥胖相关代谢紊乱提供了理论依据。本研究也为从微生物组靶点的角度理解草药提取物的体内作用打开了一扇新的窗口。