环肽药物的筛选策略

环肽是当前药物发现工作中最多样化的架构之一。它们的大小、稳定性和易于合成为参与和调节一些最具挑战性的目标提供了有吸引力的支架，包括蛋白质-蛋白质相互作用和那些被认为是“不可成药”的。凭借各种复杂的筛选技术产生环肽库，包括  噬菌体展示、mRNA 展示、肽和蛋白质的拆分蛋白环式连接  ，以及计算机筛选，环肽药物发现处于现代医学的前沿。本文首先讨论过去二十年来批准用于临床的环肽，特别关注合成化学以从头生成环状肽库和筛选的新方法，另外还阐述了以产生环状肽作为可行治疗选择的未来前景的观点，并讨论了目前将它们推向市场的优缺点。    

01  简介  

一个世纪前，胰岛素的发现永远改变了环肽药物研究领域。胰岛素可以说是当今数百万糖尿病患者所依赖的最具影响力的药物之一，它是一种高度复杂的环肽激素，通过多个二硫键连接在一起。根据 FDA批准的治疗性肽和蛋白质数据库，已有超过60 种环肽被引入临床，每年约有一种进入市场。虽然这个数字可能看起来很小，目前大多数临床批准的环肽药物主要限于天然产物衍生。凭借新合成方法的力量、体外进化、从头筛选工作以及计算机筛选的进步，环肽药物领域已为未来做好了准备。

环肽分子量小（~500-3000 Da）、具有高亲和力和特异性和易于合成的能力，仍然是现代药物发现工作中最有吸引力的分子。与线性化合物相比，环化所施加的构象限制可以使环肽对内源性蛋白酶的蛋白水解具有高度抵抗力。此外，环肽的刚性可以改善其吸收的药代动力学和药效学特性，并对它们的能力产生显著影响被动渗透膜到达细胞内目标。例如，许多环孢菌素是源自真菌的小环肽，用于治疗多种疾病，它们表现出“变色”的灵活性，它们可以在几种不同的构象之间转换。这种独特的特性是导致它们非常高的被动膜通透性特征，并且主要工作集中在理解基本原理以概括环肽中的这些特性。

过去二十年来FDA 批准的环肽，特别关注新的合成、重组和计算机方法以从头生成环肽，并分析它们在文库合成和筛选中的优势和局限性。虽然许多障碍限制了将环肽转化为临床，但本文通过集中讨论当前面临的挑战和正在开发的方法来潜在地规避将环肽推向市场的一些障碍。

过去二十年来FDA 批准的环肽约有20种（见表1），证实了环肽可以表现出与小分子和抗体疗法相似的特性。

表1 近20年FDA 批准的环肽药物

由于没有既定的方案来可靠地预测膜通透性，因此FDA在过去二十年批准的大多数环肽都针对 细胞外蛋白 。其中包括一些重磅药物，例如流行的抗生素— 达托霉素 于 2005 年被FDA批准，口服肠易激综合征药物利那洛肽于2012年获得FDA批准。在过去二十年批准的许多其他药物中，小分子和抗菌环肽作用于经典靶点G点蛋白偶联受体 （GPCRs） 。

02  生物活性环肽的兴起  

随着现代技术来合成和筛选高亲和力和特异性结合靶标的环肽构象的发展，生物活性环肽的发现呈指数级增长 。此外，自动化合成的进步简化了环肽的微调，表现出理想的药理特性，被认为是药物发现中的活性“生物学相关”候选者。下面讨论从头设计的环状肽作为可行的治疗方法集中在概念不同的方法上，总体目标是识别高效、选择性和稳定的环状肽，有可能将药物发现的模式从小分子和抗体转变为这类新型分子。

噬菌体展示

George P. Smith 在1985年发现了噬菌体展示并在2018年获得了诺贝尔化学奖。在他的文章中，证明肽可以展示在噬菌体的外部，噬菌体是感染细菌的病毒，而编码它们的遗传信息则保留在病毒的内部。这种基于亲和力的体外技术的后续优化导致针对蛋白质和核酸靶标筛选可包含大约108个成员的库，以识别高亲和力结合物。在选择和扩增之后，可以对热门靶点进行解码和化学合成或在大肠杆菌中重组表达，以进行体外和体内分析。

近年来，许多实验室率先开发了这种技术，用于开发含有独特闭环化学、引入非经典氨基酸和药效团生物偶联的环肽库。

其中一些工作的最前沿是来自 Ratmir Derda 实验室 的一系列环化化学物质。自从他开始独立的职业生涯以来，Derda的实验室已经扩大了基于半胱氨酸的噬菌体环化技术的范围，以生成大量的光电开关和糖肽文库。最近，Derda实验室修改了其环化化学，以安装非天然药效团，使用Knorr 吡唑化学靶向碳酸酐酶 (CA) ，这是一种负责催化二氧化碳和水之间相互转化的必需酶 （见图1）

图1：包含随机序列的环状肽的噬菌体展示文库

在类似的研究中， Fasan实验室 通过利用琥珀终止密码子技术引入O-（2-溴乙基）-酪氨酸，建立了一种新的策略，使噬菌体上的肽环化，该酪氨酸可以在翻译后与近端半胱氨酸残基自发反应，生成不可还原的硫醚键 （见图2）

图2：噬菌体文库合成文库和靶标验证概述

在此基础上， Bogyo实验室 引入了一种优雅的无偏见噬菌体展示筛选策略，以识别蛋白质靶点的不可逆共价抑制剂。通过加入半胱氨酸反应性乙烯基砜或通过肟的丝氨酸反应性二苯基膦酸酯弹头与1，3-二氯丙酮 （DCA） 的连接，环肽文库可以通过DCA修饰的弹头与文库中的两个半胱氨酸残基反应生成 （见图3）

图3：将含有随机序列的环肽的噬菌体展示文库与1，3二氯丙酮弹头反应，以生成针对TEV和FphF的文库。

肽和蛋白质的拆分蛋白环式连接

SICLOPPS是一种新的方法，通过利用intein的功能筛选活细胞中的环肽， intein是一种能够剪接出其侧翼外蛋白结构域的自激蛋白结构域 。在这项技术中，感兴趣的环肽以IC −X−IN的形式插入到分裂的内肽之间，其中“X”表示选择的环肽序列。翻译后，两个内含子片段将自我结合，剪接出它们之间的环肽，释放出含有天然酰胺键的环肽 （见图4） 。

图4：SICLOPPS抑制HIF-1α/HIF-1β蛋白的机制和作用概述−蛋白质相互作用

mRNA展示

mRNA展示是另一种有效的体外筛选方法。 随机非标准肽整合发现 （RaPID） 是由Hiroaki Suga实验室于2006年推广的一种mRNA显示方法。这种独特的策略利用了灵活的tRNA合成酶，允许各种非天然氨基酸被结合，包括D-氨基酸、N-甲基氨基酸和β-氨基酸，从而显著增加了筛选的化学空间。此外，N-末端甲酰基Met的遗传密码重编程可以被氨基酸 （如N-氯乙酰基-L-Tyr） 取代，以与近端半胱氨酸残基自发环化，生成环肽库。最近，Suga实验室利用RaPID系统对因子XIIa （FXIIa） 催化结构域进行了有效和选择性的抑制剂，这是开 发抗血栓药物的重要靶点 （见图5） 。

图5：鉴定FXIIa和K-Ras抑制剂的mRNA显示概述（G12D）。

结构导向设计

在 Grossmann实验室 最近的研究中，环肽设计抑制剂以模拟Ecadherin的β-片特性，以开发Tcf4和β-连环蛋白之间相互作用的抑制剂。β-catenin是一种转录辅激活因子，也是Wnt信号通路的关键组成部分。这种特定致癌靶点的过度激活导致多种癌症，使其成为治疗干预的解剖靶点。利用先前发表的晶体结构，合成了具有诱导β-片特征和模拟Ecadherin结合模式的残基的环肽。使用体外荧光偏振 （FP） 测定法，测定了环肽的结合常数。在该测定中，竞争性结合是通过荧光偏振的变化来检测的，荧光偏振是在竞争性配体将荧光标记的Tcf4配体从β-连环蛋白中置换出来时发生的。他们在最初设计中表现最好的是大环12，显示IC50=16μM （见图6） 。

图6：Tcf4/β-catenin蛋白的大环抑制剂−蛋白质相互作用

03 如何将更多的环肽带入市场？  

尽管环肽有许多明显的优势，但仍有挑战性 。一种普遍的观点是环肽对蛋白水解有很强的抵抗力。这是一个常见的误解。虽然环肽通常比线性对应物更稳定，它们仍然可以在体内快速降解。提高环肽蛋白水解稳定性的一种常用方法是 引入额外的环约束，生成双环肽 。Grossmann 和Walensky 的开创性工作已经实施了这项技术来稳定各种双环肽，用于各种生物分子靶标。特别感兴趣的是使用噬菌体展示来筛选和鉴定有效和稳定的双环肽。Heinis 和Winter 的开创性工作实施了这项技术来生成激肽释放酶的双环肽抑制剂，激肽释放酶是一种负责诱导蛋白水解的酶。稳定环肽的另一种常用方法是引入非天然氨基酸，例如D-氨基酸。Partridge 等人最近的一份报告，将所有L-氨基酸转化为D-氨基酸，确定了致癌MDM2/p53相互作用的有效环肽。

结论

许多公司已经在实践中应用了本文讨论的筛选技术。例如，Bicycle Therapeutics刚刚宣布了一项针对EphA2表达导致的晚期实体瘤患者的I/II期给药试验。此外， PeptiDream公司也在不同的临床前阶段进行了许多项目，证明了从头生成的环肽的可投资性。最后，随着新的筛选技术的不断问世，如亲和选择质谱（AS-MS）的多重分析技术，以及AlphaFold等软件计算预测的进步，会看到越来越多的新公司成立，以解决将环肽推向市场这一具有挑战性的问题。

参考文献：

Xinting Li,Tim othy W.Craven, et al. Cyclic Peptide Screening Methods for Preclinical Drug Discovery ， Journal of Medicinal chemistry, 2022,65,11913-11926

作者：静待花开  

编辑人：Transparent  

来源： 医药速览 2022-11-14  

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