Cancer Cell | 空间分析技术“照亮”肿瘤微环境研究

近期，来自以色列魏茨曼科学研究所的研究人员概述了针对mRNA的空间检测方法（空间转录组学）和基于抗体的原位蛋白质检测方法（蛋白质组学）两类主要的空间分析技术，介绍了这些技术可以获取的信息类型，并描述了它们在癌症研究中的应用、发现和挑战。此外，就如何将空间分析信息整合到癌症研究中，以改善患者诊断、预后、治疗分层和新疗法的发展进行了讨论。该综述发表于2023年2月Cancer Cell，以下是文章的详细解读。

文章题目：Spatial Profifiling Technologies Illuminate the Tumor Microenvironment

发表时间：2023-02-16

发表期刊：Cancer Cell

主要研究团队：以色列魏茨曼科学研究所

影响因子：38.585

DOI：10.1016/j.ccell.2023.01.010

肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）由许多不同的细胞和非细胞成分组成，它们共同驱动肿瘤的生长、侵袭、转移和对治疗的反应。人们越来越认识到TME在癌症生物学中的重要性，已经将癌症研究从以癌症为中心的模型转变为将TME视为一个整体的模型。空间分析方法的技术进步有望捕捉TME的复杂性。这些方法允许在保留组织结构的同时测量组织样本中多种蛋白质和转录物的表达。近年来，技术发展提高了空间和分子分辨率，使我们对TME的理解越来越清晰。

1空间转录组学

1.1 基于空间索引的方法

空间索引方法（spatial indexing approaches）使用条形码探针与RNA分子局部杂交，然后RNA分子直接在基因芯片上进行cDNA合成，使用二代测序对基因表达谱进行定量，同时使用条码探针映射回其空间坐标，从而保留空间信息。不同的索引技术在条码探针的空间分布方式上有所不同，包括磁珠（如Slide-seq、Drop-seq和HDST）、簇状阵列（如ST、Seq-Scope）、微孔（如XYZeq），和DNA纳米球（如Stereo-seq）等。

基于空间索引的方法能够以无偏倚方式检测整个转录组，不需要预先了解目标基因。由于空间索引依赖于polyA杂交，因此这些方法面临的挑战是组织中mRNA的完整性，对于福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的样品还需要进行技术改进。这是癌症研究的一个重要考虑因素，因为临床样本通常保存为FFPE块。此外，实现单细胞分辨率仍然是技术和计算方面的挑战。

1.2 基于成像的方法

基于成像的方法是使用原位mRNA分子的荧光标记、高分辨率荧光显微镜来检测和区分单个mRNA转录本。多路复用是通过执行标记、成像和信号去除的循环来实现的，其中不同的方法在这些基本步骤的实现上有所不同。

基于原位测序的方法是使用结合mRNA或逆转录cDNA的挂锁探针，以创建合成条码序列或部分基因序列的局部扩增。不同方法的区别在于原位cDNA合成方式：利用滚动环扩增，如ISS、FISSEQ和PLISH；以RNA为模板的DNA连接酶，如BOLORAMIS；定制挂锁探针，如BaristaSeq、SCRINSHOT、ExSeq和STARmap。

基于杂交的方法是通过在mRNA上添加多个探针来实现信号扩增（如MERFISH、SeqFISH、osmFISH、split-FISH和EASI-FISH），使用预先合成的扩增结构，如支链RNA（如RNAScope），进行多轮连续杂交反应（如HCR、SABER-FISH），或者使用点击化学（如ClampFISH）。

基于成像的方法能够直观的在组织空间位置上解析数据，但该方法一个主要的挑战是原位的mRNA丰度较低且经常被降解，需要不断的优化技术以提高空间分辨率。

基于mRNA的空间分析技术

2空间多重蛋白质组学

2.1 循环显微方法

由于光谱重叠，光学显微镜和荧光显微镜只能同时检测少数靶标。为了增加成像的靶标数量，循环显微镜方法执行检测过程涉及以下三个步骤：使用标记抗体进行组织染色；图像采集；信号灭活或去除。迭代上述基本流程可以增加成像的蛋白质数量，但仍有几个挑战。首先，该过程非常耗时，这可能会阻碍吞吐量。其次，组织和表位完整性可能会在周期中下降。第三，由于去除不完全，来自一个循环周期的信号可能会转移到另一个周期。

2.2 基于质谱的方法

基于质谱的方法使用附着在独特金属同位素上的抗体，其可以使用质谱进行区分。抗体利用金属标签标记，在单次反应中应用于染色组织。为了获得空间信息，组织样本被分成致密网格，并使用质谱法读取每个像素的所有目标蛋白质的表达。与基于显微镜的方法不同，这种方法对组织具有破坏性。

基于蛋白质组学的空间分析技术

3癌症研究中的空间分析技术

空间分析技术的输出是描述每种蛋白质或RNA转录本空间表达模式的多维图像。因此，该技术可提供巨大的数据集，通常跨越数以万计的图像。该图像集合包含多层信息，包括单细胞表型、单细胞形态、组织中细胞的组成、细胞间相互作用、多细胞结构等。

空间分析技术在癌症研究中的作用

3.1 单细胞分析和细胞组成

空间分析数据包含有关组织中单个细胞的身份和表型信息。空间分析技术可加速对癌症细胞组成的大规模和系统评估。在单细胞分辨率方法中，首先是根据细胞核、细胞质或膜染色对细胞进行分割。新颖的分割方法主要依赖于人工策划的训练数据来预测细胞边界，使用监督式机器学习。分割后，将每个mRNA或蛋白质的表达分配给每个细胞，产生表达基质。随后使用聚类和分类算法将细胞分类为细胞类型。

3.2 细胞相互作用和微环境生态位

除了有关细胞类型和状态组成的信息外，空间分析技术还可获取细胞物理位置信息、直接相互作用、共享微环境生态位的细胞间近距离相互作用，以及组织微解剖结构。空间组织的多层次推断，主要通过自上而下或自下而上的方法进行分析。自上而下的方法侧重于特定的解剖结构，例如前缘、肿瘤核心和边界，基于先前的知识或组织学信息，识别不同区域的独特特征，包括基因表达、细胞组成、相互作用等。自下而上的方法侧重于识别组织内的细胞互作模式，以推断高阶组织结构。这些方法可分为评估成对相互作用的方法和评估多细胞相互作用的方法。多细胞相互作用分析可揭示复杂的富集模式，其中可能涉及两种以上的细胞类型。这些富集模式通常被称为细胞邻里、生态位、群落、微环境或隔间。识别微环境生态位的常见方法包括按细胞组成对区域进行聚类，并将区域检测算法应用于蜂窝连接图。

4空间分析技术应用于癌症研究中所面临的挑战

空间分析技术在癌症中的应用有望揭示TME的结构和功能，但该领域仍处于起步阶段，需要克服若干挑战才能发挥其全部潜力。当前可用技术的最大挑战之一是吞吐量有限。癌症相关研究需要大队列来克服肿瘤间和肿瘤内的异质性并获得有意义的结果。

所有现有技术都在成本、时间和技术性能之间进行了权衡。空间分辨率、测量的mRNA或蛋白质的数量，以及结果数据的质量，包括特异性和敏感性，也可以通过技术相互交换。例如，提高空间分辨率在大多数技术中都是可能的，并且有望提高数据质量，但目前需要大幅增加成像时间或成本。同样，使用预先校准的试剂可以加快实验速度，但通常会限制所分析的分子靶标的数量和种类。

空间分析技术的挑战、考虑和权衡

5结论

目前已有多种技术可用于组织的空间析技术，且新颖和改进的技术也在不断涌现。不同的方法在复用能力、简便性、分辨率、成本、检测低丰度信号的能力、与临床标本的兼容性等方面有所不同。选用空间分析技术时应考虑这些差异，并应根据所解决的研究问题、可用仪器和专业知识进行选择。

空间分析技术揭示了肿瘤生态系统中的细胞相互作用和微环境。研究表明，这些特征与患者的临床结果有关。因此，预计在不久的将来，需引入新的生物标志物用于患者诊断和分层，以便在了解多种蛋白质/基因间相互作用的基础上进行个体化治疗。

此外，这些微环境见解可以促进开发相关的联合疗法或针对相互作用蛋白质的双特异性抗体。总之，空间分析技术的发展将提高人们对TME的理解，并将在癌症研究和临床护理中发挥重要作用。