科研丨香港浸大＆马萨诸塞大学: 微生物群介导的结肠组织中三氯生氧化代谢物的再激活(国人佳作)

编译：微科盟煎蛋，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读  

三氯生(TCS)是一种广泛使用的抗菌剂，与许多不良的健康结果有关。其肠道毒性被归因于共生微生物介导的分子修饰，但肠腔内TCS衍生物的微生物转化仍在很大程度上未知。芳香羟基化是TCS的主要氧化代谢，与其在宿主组织中的毒理作用有关。结肠是肠道微生物的主要定植部位，本研究旨在揭示羟基-TCS(OH-TCS)在结肠中的生物学命运。与通过宿主代谢生成的图谱不同，从队列研究中发现，OH-TCS在人类粪便中仍未结合。通过追踪小鼠肠道中的分子组成，在结肠消化物和黏膜中观察到游离型OH-TCS丰度升高，而结合型OH-TCS丰度降低。通过使用抗生素处理、无菌小鼠以及体外方法，我们证明肠道微生物编码酶可以有效地将宿主代谢产生的葡糖苷酸/硫酸盐结合的OH-TCS转化为结肠组织中的生物活性游离形式。因此，我们提出了TCS衍生物的宿主-肠道菌群代谢相互作用。这些结果揭示了微生物代谢在TCS毒性中的关键作用，并强调了在环境化学品健康风险评估中纳入肠道微生物转化的重要性。

图文摘要

论文ID

原名：Microbiota-mediated reactivation of triclosan oxidative metabolites in colon tissues

译名：微生物群介导的结肠组织中三氯生氧化代谢物的再激活

期刊：Journal of Hazardous Materials

IF：14.224

发表时间：2022.11

通讯作者：蔡宗苇，张国栋

通讯作者单位：香港浸会大学化学系；美国马萨诸塞大学

DOI号：10.1016/j.jhazmat.2022.130509

实验设计

结果

1、人体粪便中OH-TCS种类分布

羟基化是TCS在宿主组织中的主要氧化代谢反应之一。我们前期研究表明，由于共生微生物的代谢功能，游离形式的TCS在肠道中占主导地位，导致肠道与其他组织的代谢谱不同。因此，我们假设OH-TCS在肠道中表现出相似的特征。即肠道微生物会将宿主代谢产生的结合OH-TCS(主要是OH-TCSG和OH-TCSS)转化为游离形式(图1A)。为了验证此假设，我们首先分析了OH-TCS种类的丰度，包括人体粪便中的游离型和结合型。使用了先前队列研究的样本，在该研究中，受试者使用有或无TCS的HPCPs 4个月(图1B)。UHPLC-HRMS分析显示，粪便中仅检测到游离形式的OH-TCS，未检出结合型OH-TCSG和OH-TCSS。与对照组相比，使用含TCS的HPCPs的受试者在4个月内粪便中游离形式的OH-TCS丰度更高(图1C)。值得注意的是，对照样品中的OH-TCS检测表明TCS在我们的环境中无处不在。事实上，除了直接使用含有TCS的HPCPs外，人类还可以每天通过其他产品和途径(如食物消化和空气吸入)接触到TCS。我们想指出的是，OH-TCSG和OH-TCSS的UHPLC-HRMS信号缺失并不意味着这些偶联物由于缺乏标准化合物而在人类粪便中不存在，因此进一步进行了动物研究。

图1

人类粪便中OH-TCS代谢物的特征。(A) TCS氧化代谢物代谢命运的假设。(B)实验方案概述。人类受试者使用无TCS(对照组，n=7)或有TCC(TCS组，n=6)的HPCPs长达4个月。每月采集一次粪便样本进行分析。(C)人类粪便中OH-TCS的半定量。PA，UHPLC-HRMS检测到的峰面积，相对于对照组的平均值。

2、小鼠肠道中OH-TCS种类分布

用含有80 ppm TCS的饮食喂养小鼠28天(图2A)，并使用UHPLC-HRMS分析一系列小鼠样品中OH-TCS的代谢谱。参考之前的研究采用了这种处理方案，其中TCS的血浆水平与暴露于TCS的人类受试者相当。宿主组织中的TCS浓度及其在小鼠胃肠道中的分布如图S2所示。肝脏作为宿主代谢的中枢器官，可以催化TCS羟基化并将一系列代谢物排泄到胆汁中，结合物为主要形式。宿主组织中TCS代谢谱表现出了与前期研究类似的模式(图2B)。值得注意的是，在小鼠心脏中检测到OH-TCS，表明这些化合物的血液循环。宿主来源的代谢物可以通过胆管进入小肠，最终通过肠道进入结肠。我们进一步分析了远端小肠和结肠中游离型OH-TCS、OH-TCSG和OH-TCSS的分布情况，并比较了它们在消化物和黏膜中的丰度。研究结果显示，与远端小肠相比，游离形式的OH-TCS显著增加(HRMS信号约为8.5倍)，而结肠消化物和黏膜中的OH-TCSG和OH-TCSS明显降低(图2C)。这些结果表明，OH-TCS种类的组成在通过肠道时发生了变化，游离形态代谢物的丰度升高。这与人类样本中的观察结果一致，其中仅在粪便中检测到游离形式的OH-TCS。值得注意的是，在人体胃肠道内，绝大多数共生微生物存在于结肠中，估计约有1014个细菌，而小肠的贡献可以忽略不计(小于1012个细菌)。因此，我们重点研究了结肠组织中的共生微生物代谢。

图2

宿主组织中OH-TCS的产生及其在小鼠胃肠道中的分布。(A)实验方案。给小鼠喂食含有80ppm TCS的饮食28天(每组n = 10)。(B)小鼠肝脏、胆汁和心脏中OH-TCS代谢物的半定量。(C)小肠和结肠(消化物和黏膜)中OH-TCS的半定量。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

3、肠道微生物组耗竭对小鼠结肠中TCS羟基化的影响

使用ABX介导的抑制肠道微生物群的方法来确定微生物群在OH-TCS形成中的功能作用(图3A)。与之前的研究一致，通过针对16S rRNA基因的qPCR测定分析，这种抗生素策略有效地消耗了小鼠肠道中的大多数微生物(图S3)。在实验结束时，收集结肠消化物和黏膜以比较有或无抗生素处理的游离形式OH-TCS、OH-TCSG和OH-TCSS的丰度。UHPLC-HRMS分析表明，抗生素抑制肠道微生物组可显著降低游离形式的OH-TCS水平(基于HRMS信号，降低约86%)，同时增加了结肠消化物中结合型OH-TCSG和OH-TCSS的丰度(图3B)。在相应的黏膜中也观察到一致的趋势(图S4)。

接下来，我们进行了一项时间进程研究，以进一步验证肠腔中观察到的结果。具体来说，用抗生素预处理小鼠一周以抑制微生物生物量，然后接受单次口服灌胃TCS(图3C)。析4、8、12、24 h时OH-TCS代谢产物在结肠组织中的分布。在灌胃后24小时内，抗生素预处理导致的肠道微生物组消耗显著降低了游离形式OH-TCS的丰度，同时提高了小鼠结肠消化物中OH-TCSG和OH-TCSS的水平，通过时间依赖性曲线和曲线下面积(AUC)分析进行评估(图3D-F)。在结肠黏膜中也观察到类似的趋势(图S5)。这些结果与图3B的结果非常一致，支持微生物群是结肠中活性游离形式OH-TCS再生所必需的。

图3

抗生素介导的肠道微生物群抑制对结肠TCS羟基化的影响。(A)实验方案。小鼠接受有或无抗生素鸡尾酒的饮用水，并用含有TCS的饮食处理(每组n=10)。(B)抗生素处理降低了结肠消化物中游离形式的OH-TCS，增加了OH-TCSG和OH-TCSS。(C)实验方案。小鼠先

用有或无抗生素预处理一周，然后用TCS口服灌胃(每个时间点n=5)。(D-F)抗生素处理以时间依赖性方式减少结肠消化物中游离形式的OH-TCS，增加OH-TCSG和OH-TCSS。AUC，曲线下面积。*P<0.05，***P<0.001。

4、无菌小鼠中OH-TCS种类分布

此外，无菌小鼠被用来证实肠道微生物群在结肠中OH-TCS代谢命运中的作用。我们分别给无菌小鼠和常规小鼠口服一次TCS，然后在灌胃8小时后分析结肠组织中OH-TCS代谢谱(图4A)。与常规小鼠相比，无菌小鼠结肠消化物和黏膜中游离形态OH-TCS的丰度降低，而OH-TCSG和OH-TCSS丰度显著增加(图4B-C)。这些发现与使用抗生素方法的结果一致(图3)，支持了我们的假设，即微生物群将结合型OH-TCS代谢物(例如OH-TCSG和OH-TCSS)转化回非结合形式，导致游离形式的OH-TCS在结肠组织中积累。

图4

无菌小鼠结肠中OH-TCS代谢物的分布。(A)实验方案。无菌小鼠或常规小鼠给予TCS单次灌胃(每组n = 5)。(B-C)与常规小鼠相比，无菌小鼠结肠消化物和黏膜中游离型OH-TCS降低，OH-TCSG和OH-TCSS增加。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

5、肠道细菌对体外TCS代谢的影响

为了进一步探索肠道微生物群在TCS代谢中的作用，我们在厌氧条件下培养了肠道细菌，并测试细菌是否可以催化TCS转化为OH-TCS。我们将TCS与来自人类粪便、小鼠粪便、结肠和小肠的肠道细菌孵育48小时(图5A)。UHPLC-HRMS未能检测到游离形式的OH-TCS，OH-TCSG或OH-TCSS(图5B)。这一结果表明，至少可培养的肠道细菌不能直接将TCS转化为OH-TCS，肠道腔内的OH-TCS来自宿主代谢。如图2C所示，暴露于TCS的小鼠的小肠消化物含有高丰度的结合OH-TCS种类。接下来，我们分析了与粪便细菌体外孵育是否会改变小肠消化物提取物中OH-TCS种类的代谢特征。结果表明，与对照组相比，人或小鼠粪便细菌的孵育增加了游离形态的OH-TCS，而减少了结合型OH-TCSG和OH-TCSS，证明了OH-TCS的解偶联(图5C-D)。我们进一步进行了体外实验，以解析其中所涉及的肠道微生物酶。结果表明，微生物衍生的GUS和硫酸酯酶有效地将结合OH-TCSG和OH-TCSS转化为游离形式的OH-TCS(图5E-F)。

图5

体外实验。(A)实验方案。TCS与肠道细菌孵育48小时，分析OH-TCS的形成(每组n = 3)。DMSO被用作溶剂赋形剂(Veh)。(B)肠道菌群不能在体外直接催化TCS羟基化。HFB，人类粪便细菌。MFB，小鼠粪便细菌。(C)实验方案。将肠道细菌与TCS处理小鼠的小肠消化物提取物孵育，然后通过UHPLC-HRMS分析OH-TCS种类(每组n=3)。(D) OH-TCS种类的相对水平。HFB，人类粪便细菌。MFB，小鼠粪便细菌。(E)用有/无微生物源性GUS和硫酸酯酶处理的OH-TCS的相对水平。(F)体外证据表明，微生物源性GUS和硫酸酯酶参与OH-TCS的解偶联。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

讨论

TCS于1964年首次引入商业，五十多年来一直被广泛用作抗菌剂。这种高度亲脂性的化合物很容易从胃肠道和皮肤吸收，导致世界上很大一部分人群在体液和组织中可检测到TCS。先前的研究表明，TCS进入人体后，在宿主组织中迅速代谢(主要是在肝脏中)，通过葡萄糖醛酸化和磺化的II期反应产生代谢产物。这些结合代谢物的活性低于母体化合物，并且被认为可以通过尿液和粪便从体内排出。在人类中发现的主要代谢物是TCS-G，并且在终末血浆半衰期短于24小时时发生快速周转。然而，在过去的十年中，TCS因其对肝脏和结肠(TCS代谢物产生并储存用于粪便排出的组织)的潜在促癌作用而引起了公众的极大关注。进一步的研究支持TCS的生物转化过程有助于其毒性机制的形成。在肝脏中，CYP介导的氧化代谢也会产生可能诱导肝毒性的活性代谢物，尽管这些代谢物随后通过葡萄糖醛酸化和磺化经历了哺乳动物II期代谢失活。在结肠中，我们最近的研究首次证明了TCS-G进入肠道后，肠道共生微生物介导TCS-G母体化合物TCS的再生，并驱动其肠道毒理学。事实上，以前关于TCS生物学命运的研究主要集中在哺乳动物宿主组织中的代谢上，而肠道微生物群介导的转化研究还相当不足。本研究阐明了这种解偶联过程广泛发生在肠腔中，也导致TCS活性代谢物的再生，这是一种容易被低估的宿主组织毒性产物。

在这项研究中，我们提供了一系列有力支持上述假设的证据。以前关于TCS宿主代谢的研究表明，TCS羟基化经常发生在肝脏中，随后与葡萄糖醛酸和硫酸盐结合。为了揭示所涉及的肠道微生物代谢，我们首先使用队列研究来确定人类粪便中的OH-TCS谱，结果显示，对于使用含TCS产品的受试者，羟基化代谢物以游离形式存在于粪便样本中(图1C)。接下来，我们试图通过动物实验来追踪OH-TCS的产生和代谢。在暴露于TCS的小鼠中，OH-TCS种类的特征在这些代谢物通过肠道的过程中发生了实质性变化。值得注意的是，结肠组织中游离形式的OH-TCS增加，而结合形式减少(图2)。然后应用抗生素抑制肠道菌群的策略来评估肠道微生物的代谢作用。我们的数据显示，肠道微生物群的耗竭显著减少了游离形式的OH-TCS，同时增加了结肠消化物和黏膜中OH-TCSG和OH-TCSS的丰度(图3)。无菌小鼠的结果进一步支持了这一观点(图4)。此外，体外实验结果表明，肠道微生物主要通过微生物编码的GUS和硫酸酯酶介导OH-TCS解偶联(图5)。总的来说，这些结果表明，肠道微生物群有效地解偶联葡萄糖醛酸/硫酸盐结合的OH-TCS，这些OH-TCS来源于宿主氧化代谢，在结肠组织中重新生成游离形式的活性OH-TCS。

因此，我们基于本文和以前的研究提出了TCS衍生物的宿主-肠道微生物群代谢相互作用。如图6所示，产品和环境中的TCS一般通过摄入、皮肤吸收或吸入进入人体。它被迅速吸收进入血液循环，并进入肝肠轴进行代谢过程。对于宿主组织特异性代谢，TCS经历I期羟基化和/或II期偶联，与葡萄糖醛酸和硫酸盐形成无生物活性的偶联物，随后在胆汁中排泄并进入肠道进行消耗。然而，肠道微生物群通过编码酶介导这些化合物的解偶联，导致游离形式的TCS和羟基化种类在结肠组织中积累。值得注意的是，肠黏膜是结肠组织与微生物产物相互作用的主要部位。我们证明了结肠黏膜中TCS衍生成分的丰度与腔中的丰度呈正相关，从而对宿主健康构成潜在风险。据我们所知，这是结合肠道微生物转化的最完整的TCS代谢网络。偶联反应后的两种清除途径是肾尿和胆粪。分子量(MW)被认为是化合物胆汁排泄水平的重要因素。通常，大多数低分子量的化合物通过肾脏迅速清除，并在胆汁中排泄不良，而分子量较高(>325 kDa)的化合物可以通过胆道途径显著排泄。对于TCS，TCS和OH-TCS的葡萄糖醛酸/硫酸盐偶联物(均>325 kDa)可以分泌到胆汁中并进入小肠，然后向下移动到主要发生微生物代谢的结肠。事实上，肠道微生物总共编码的基因比人类基因组多150倍，包括可以介导各种生化反应的丰富酶库。

图6

本研究通过梳理宿主组织和肠道微生物群之间的相互作用，提出了TCS的主要代谢命运。GM，肠道微生物群；GI，胃肠道。 

来自人类微生物组计划(HMP)的测序数据表明，肠道微生物群含有数百种独特的微生物GUS酶，这些酶根据活性位点特征分为六类。不同微生物组编码的硫酸酯酶蛋白也在结肠中广泛表达。与图5E-F所示的体外结果一致，这些微生物酶的作用可以解释葡糖苷酸和硫酸盐偶联物在肠道中的水解转化。值得注意的是，TCS及其氧化代谢物的再激活引起了一些健康问题。首先是其直接的胃肠道毒性。当微生物酶水解偶联物时，它们会将活性游离形式的化合物释放到肠腔中，这可能是加剧炎症性肠病(IBD)的潜在机制。事实上，IBD的特征是肠黏膜的慢性炎症，我们的结果清楚地表明，这些游离形式的活性代谢物可以积聚在黏膜组织中。另一个关键问题是这些生物活性化合物的肝肠再循环。这一过程控制了许多内源性和外源性化合物的循环，导致它们在体内的停留时间增加。因此，通过细菌依赖性代谢产生的游离形式的TCS和OH-TCS可能会被重新吸收到血液中并调节对宿主组织的毒性。此外，胃肠道中TCS相关化合物的长期激活可以塑造个体的微生物类型或诱导抗生素耐药性。众所周知，肠道微生物组的组成主要由环境因素决定。先前的研究表明，在使用含TCS牙膏的母亲粪便样本中观察到变形菌门的富集，并且尿中TCS水平较高的婴儿粪便中也显示出变形菌门物种的显著富集。值得注意的是，变形菌增多可能是生态失调、疾病风险和抗生素抗性基因增加的潜在诊断标志物。动物研究还显示，TCS处理导致双歧杆菌属的肠道丰度降低约75%，这与抗炎作用有关。

尽管TCS代谢物的解偶联在肠道微生物酶的催化下普遍发生，但肠道中存在反应效率的个体间差异。不同的人类受试者有自己特定的肠道微生物组成，表达一组独特的微生物GUS和硫酸酯酶，导致环境改变时化合物偶联的能力不同。我们之前的研究表明，特异性Loop 1和黄素单核苷酸(FMN)结合GUS是体外将TCS-G转化为TCS最有效的酶直系同源物，而Loop 1 GUS表现出广泛的丰度水平，139名人类受试者中约有40%的粪便微生物群中没有这一类别。我们承认，由于缺乏化学标准，这项研究的主要局限性是无法定量OH-TCS浓度。然而，先前的研究表明，在暴露于TCS的小鼠肝脏中，宿主生成的OH-TCS不容忽视。此外，游离形式的OH-TCS肠道毒性需要进一步确认。尽管我们证明了OH-TCS可以很容易地被肠黏膜吸收，但OH-TCS对肠道健康的直接影响仍然不清楚。尽管存在这些局限性，但本研究提供的数据为结肠组织中TCS代谢物的再激活提供了足够的证据，并结合微生物-哺乳动物共代谢阐述了TCS的代谢途径。这对于TCS应用的安全性评估具有重要意义，因为人类很可能会终生接触这种抗菌成分。这项工作还为探索其他环境化合物的代谢途径和相关健康风险提供了一种方法。未来的研究将包括使用OH-TCS及其偶联物的标准化合物探索TCS相关的肠道毒性。

结论

本研究首次描述了由肠道微生物群介导的TCS氧化代谢物的代谢网络。芳香族羟基化是TCS在宿主组织中的主要氧化反应，随后在胆汁-粪便排泄前通过与葡萄糖醛酸或硫酸盐结合部分进行II期失活。然而，我们发现在暴露于TCS的受试者粪便中OH-TCS代谢物存在解偶联。进一步的动物研究表明，与小肠相比，结肠中游离形式的OH-TCS丰度升高。通过抗生素处理、无菌小鼠和体外细菌培养等方法，我们证明了先前的假设，即肠道微生物将源自宿主代谢的葡糖苷酸/硫酸盐OH-TCS解偶联，以通过结肠组织中的GUS和硫酸酯酶重新生成生物活性游离形式。这些结果有助于更深入地了解TCS的代谢命运，并强调了阐明宿主-肠道微生物群共代谢在环境污染物安全性评估中的重要性。