MD安德森癌症中心：黑色素瘤PD-1免疫治疗与SIRPA表达高度相关！

黑色素瘤可发生于我们人体的各个地方，包括皮肤表面、内脏和神经系统中。

我国的黑色素瘤最常发生于手掌、足底、手指或脚趾，为肢端型，占比超过40%，还有20%-25%的黏膜黑色素瘤，其中最常见于肛管直肠、女性生殖道和口腔鼻腔等。除此之外，还有眼脉络膜黑色素瘤、神经系统原发黑色素瘤等罕见的黑色素瘤类型。

目前，黑色素瘤已成为世界上发病率增长最快的恶性肿瘤之一，年增长率为3%～5%。早期黑色素瘤可通过手术切除治愈，而晚期放化疗等的效果均不理想，往往很快出现疾病进展而发生死亡。

公开资料显示，2014年9月，FDA批准首款PD-1抑制剂帕博利珠单抗上市，其适应症是用于治疗无法切除或转移的黑色素瘤患者。近些年，随着临床研究不断进行，陆续有其他癌种获批适应症，并且PD-1检查点抑制免疫疗法彻底改变了癌症治疗，但治疗后也并非100%有效，许多患者表现出耐药性。

美国MD安德森癌症中心研究团队发表在《Cancer Cell》上的一篇文章，其研究结果显示PD-1免疫药物耐药和SIRPA表达缺失相关，并描述了其表达缺失是如何导致免疫治疗耐药的。文章标题为：Tumor-intrinsic SIRPA promotes sensitivity to checkpoint inhibition immunotherapy in melanoma。

大量样本显示高SIRPA表达与PD-1抗体反应相关

基于四个具有可用的转录组学数据和一个具有蛋白质组学数据共计五个黑色素瘤患者PD-1抗体治疗队列中，研究者收集了60个免疫肿瘤靶基因。在这些基因中，SIRPA在不同患者队列的差异表达分析中显示最一致（图1C）。

研究结果显示，对PD-1阻断更敏感的具有高SIRPA表达的肿瘤样本不仅在RNA水平上而且在蛋白水平上也有差异（图1D、E）。此外，多个队列的患者生存分析显示，高SIRPA表达的患者组比低SIRPA表达的患者组预后更好（图1D、E）。同时研究者发现SIRPA表达与其他治疗（如BRAF抑制剂）的反应没有相关性（图S1A和S1B）。这些结果表明，SIRPA在抗PD-1免疫治疗的肿瘤中具有积极独特的作用。

抗PD-1应答肿瘤中SIRPA高表达来源于肿瘤细胞

前期研究（Chao et al.,2019）发现，巨噬细胞上的SIRPa与肿瘤细胞或T细胞上的CD47相互作用时会触发“不要吃我”的信号，进而抑制巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用。因此阻断这种互作可以使得巨噬细胞对肿瘤细胞进行吞噬。然而，这个结论与SIRPA对于抗PD-1疗法的促进作用相矛盾。

究其原因，研究者对于来自不同诊疗背景的黑色素瘤患者进行肿瘤单细胞RNA测序，并比对了黑色素瘤转移前与发生恶性生长后的RNA与蛋白质表达水平。发现尽管患者间转录组存在显著异质性，但是SIRPA均大量表达；与此同时，通过对于黑色素瘤细胞系（WM989）和单核细胞系（U937）的单细胞蛋白质组学数据进行分析，发现SIRPA在两种细胞中均普遍高水平表达，表明了SIRPA表达来自于黑色素瘤细胞。

研究者通过使用CIBERSORTx算法用于三个RNA-seq数据集，推断每个样品的肿瘤和巨噬细胞特异性基因表达谱。发现：

1）抗PD-1治疗有效的患者的黑色素瘤细胞中SIRPA显著上调（p=0.022，图2I），但治疗有效组的巨噬细胞中SIRPA显著下调（p=0.033，图2I）；

2）与未治疗组相比，治疗后耐药组的黑色素瘤细胞中SIRPA表达较少（p=8.5X10-4，图2J）；

3）抗PD-1治疗后巨噬细胞SIRPA显著下调（p=1.1X10-7，图2K）。

总的来说，这些结果表明与抗PD-1治疗反应相关的SIRPA的高表达是由于黑色素瘤细胞，而不是巨噬细胞。

SIRPA是黑色素细胞标记物，其表达量随黑色素瘤进展而降低

研究者分析了四个连续分化阶段的人黑色素瘤细胞的RNA-seq数据库结合人黑色素细胞数据库，发现分化程度最高的黑色素细胞表现出最强的SIRPPA表达（图3A、3B），随着黑色素细胞的成熟，SIRPA的高表达状态逐渐建立（图3F、3G）。

并且发现在TERT启动子突变后，SIRPA表达水平下降；PTEN突变后，SIRPA表达水平上升。

同时发现在所有发育阶段的黑色素细胞中存在普遍的SIRPA高表达模式，且SIRPA仅在黑色素细胞中表达。发现SIRPA的表达水平与黑色素瘤肿瘤去分化高度负相关，与细胞系数据中的观察一致（图3H、J、K）。进而说明了SIRPA是一种黑色素细胞标志物，其缺失是黑色素瘤进展的标志。

SIRPA缺失通过肿瘤细胞与CD8+T细胞的互作导致抗PD-L1耐受性

此前研究显示黑色素瘤去分化是通过失去黑色素细胞抗原对T细胞介导的免疫疗法产生耐药性的已知机制。SIRPA与抗PD-1免疫治疗反应和黑色素瘤分化状态均表现出很强的正相关，并且先前研究不足。研究者假设SIRPA直接参与增强T细胞介导的免疫治疗，其损失随后作为伴随黑色素细胞身份减弱的免疫治疗耐药性的介质。基于SIRPα-CD47互作模型，结合黑色素瘤空间转录组数据库，发现在黑色素瘤细胞中SIRPA富集，并与T细胞的CD47共定位（图4A）。观察到黑色素瘤细胞和CD8+T细胞之间存在显著的SIRPa-CD47相互作用评分（p=0.008，图4B）。

为了直接确认SIRPA对T细胞依赖性肿瘤免疫反应的影响，研究者设计了一个共培养系统并进行了细胞毒性T细胞杀伤测定（图4C）。发现与非靶向对照（NTCs）相比，细胞毒性T细胞更有效地杀死具有SIRPα过表达的肿瘤细胞，而失去SIRPα的肿瘤细胞对T细胞介导的杀伤更具抵抗力（图4E）。这表明SIRPa在T细胞介导的肿瘤细胞毒性中对肿瘤细胞表面具有积极作用。为了进一步确认SIRPA在抗PD-1 / PD-L1治疗中的作用，我们将小鼠PD-L1（mPD-L1）抗体添加到共培养系统中，并观察到T细胞杀伤效果的差异比没有抗体的环境更显著（图4F、E）。之后，研究者使用能够阻断SIRPα-CD47相互作用的抗体MIAP410和MIAP430在共培养前预处理T细胞，显示SIRPα-CD47被阻断的T细胞中肿瘤杀伤作用受到阻碍（图4H）。以上结果表明，黑色素瘤细胞内表达的SIRPA可以通过PD-1/PD-L1阻断免疫治疗中的CD47相互作用有效触发T细胞免疫原性。

在小鼠中，肿瘤细胞内表达的SIRPA增强PD-1作用

为了研究黑色素瘤内源性SIRPA是否影响体内检查点抑制免疫治疗的疗效，研究者使用了B16F10小鼠黑色素瘤模型。将具过表达（mSIRPA-OE），敲低（mSIRPA-KD）和NTC B16F10细胞接种到小鼠中比较抗mPD-L1治疗的应答程度。在不同的时间点（第10、12、14和16天），3只小鼠组表现出不同的肿瘤体积变化率：mSIRPA-OE组的所有小鼠始终受益于抗mPD-L1治疗，并表现出相当大的肿瘤缩小，在某些情况下肿瘤甚至完全消失;NTC组中的大多数小鼠对治疗表现出反应，但在一小部分小鼠中，肿瘤大小增加；与mSIRPA-OE形成鲜明对比的是，mSIRPA-KD组中大约一半的小鼠患有肿瘤扩张（图5D和5E）。也就是说黑色素瘤细胞内表达的SIRPA可增强抗PD-1/PD-L1治疗。

黑色素瘤中SIRPα的表达受到SIRPAP1的正向调节

为了确定影响黑色素瘤患者SIRPa蛋白表达异质性的潜在调节因子，研究者使用RPPAs定量分析了349个TCGA黑色素瘤样品中的SIRPa蛋白表达，然后与其他TCGA分子分析数据进行了关联分析，包括DNA甲基化，体细胞突变，体细胞拷贝数改变及其内源性假基因SIRPAP1的表达。在三种顺式调控特征中，SIRPA基因扩增显示出显著的正相关，但效应量有限（图6A和6B）。SIRPAP1 RNA表达与SIRPα表达密切相关（图6A和6C）。这些结果表明，SIRPAP1是SIRPa的关键非编码调节因子。研究者使用TCGA黑色素瘤数据对miRNA候选物与SIRPA或SIRPAP1之间的表达水平进行了关联分析。鉴定了三种miRNA，let-7a-2-3p，miR-149-3p和miR-3154，它们靶向SIRPA和SIRPAP1的同源区域，并表现出与它们的表达水平显著负相关（图6D和S6D）。特别是，let-7a-2-3p与SIRPA/SIRPAP1表达的抗相关性最强（图6E和6F）。这些结果表明，黑色素瘤中SIRPA和SIRPAP1的协同调控是由一组miRNA介导的。

免疫检查点抑制通过利用人类免疫细胞的细胞毒性潜能，特别是细胞毒性T细胞，已经彻底改变了癌症治疗，然而目前仍然仅有非常有限的能力来预测患者对免疫治疗的反应。在这项研究中，专注于新兴的免疫肿瘤靶点，研究者开发了一个综合分析策略，优先考虑与抗PD-1/PD-L1治疗相结合的可操作靶点。结合黑色素瘤患者的单细胞体积和RNA-seq数据集，发现SIRPA高表达与抗PD-1治疗的良好反应相关，并且是黑色素瘤细胞而不是巨噬细胞促成了观察到的模式。通过体内和体外实验，进一步证明了肿瘤固有SIRPA促进T细胞介导的免疫治疗反应。

参考资料： 1.DOI:https://doi.org/10.1016/j.ccell.2022.10.012 2.中国黑色素瘤患者行为现状调研白皮书 

作者：医世象 叶子