作者解读丨广州医科大学张云龙教授团队揭示罗伊氏乳杆菌改善Cntnap4基因敲除小鼠惊恐记忆障碍(国人佳作)

编译：张文龙，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读   

背景：自闭症谱系障碍(Autistic Spectrum Disorder，ASD)是一种神经发育性疾病，以社会交往与社会交流障碍，刻板重复性行为及惊恐记忆异常为主要特征。ASD患者多存在胃肠道症状和肠道菌群失衡。已有研究表明接触蛋白相关样蛋白4(Contactin associated protein-like 4，CNTNAP4)基因是ASD致病基因，然而Cntnap4基因缺陷介导肠道微生物群失调参与ASD中惊恐记忆的调控机制尚不清楚。   

方法：通过构建Cntnap4基因缺陷小鼠，开展ASD相关的行为学检测；采用膜片钳和RNA-seq分析杏仁核(BLA)GABA能信号传递；16S rDNA分析Cntnap4−/−基因缺陷小鼠粪便微生物成分的变化。口服罗伊氏乳杆菌(L. reuteri)或粪便移植观察Cntnap4基因缺陷介导的恐惧记忆和社交障碍改变。   

结果：Cntnap4-/-雄鼠具有显著的社交和恐惧记忆处理缺陷且GABA传递异常。雄性Cntnap4−/−小鼠肠道罗伊氏乳杆菌和唾液乳杆菌显著减少，通过口服罗伊氏乳杆菌处理或菌群移植恢复Cntnap4-/-小鼠的恐惧记忆和社交缺陷，并缓解BLA脑区的GABA传递。  

结论：罗伊氏乳杆菌通过上调BLA脑区GABA能突触传递改善自闭症小鼠的惊恐记忆障碍和社交缺陷。

论文ID

原名：Lactobacillus reuteri normalizes altered fear memory in male Cntnap4 knockout mice

译名：罗伊氏乳杆菌改善雄性Cntnap4-/-小鼠的惊恐记忆缺陷

期刊：eBioMedicine

IF：11.205

发表时间：2022.11

第一作者：张文龙、黄洁、高峰、尤强龙

通讯作者：张云龙

通讯作者单位：广州医科大学

DOI号：10.1016/j.ebiom.2022.104323

实验设计

主要内容

自闭症谱系障碍(Autistic Spectrum Disorder，ASD)是一种在儿童或童年早期发病的神经发育性疾病，以社会交往与社会交流障碍，刻板重复性行为及狭窄兴趣为主要特征[1]。目前尚无有效的治愈手段。其发病率近年来明显上升，给患者家庭和社会带来了沉重负担。已有研究表明接触蛋白相关样蛋白4(Contactin associated protein-like 4，CNTNAP4)基因是ASD致病基因[2]，且ASD患者多存在胃肠道症状和肠道菌群失衡，推测ASD患者的胃肠道功能障碍和肠道菌群结构变化与其发病密切相关。课题组前期报道Cntnap4基因缺陷参与帕金森病的发病机制[3]。然而Cntnap4基因缺陷介导肠道微生物群失调参与ASD中惊恐记忆的调控机制尚不清楚。 近日，广州医科大学张云龙课题组在eBioMedicine发文揭示了罗伊氏乳杆菌通过提高BLA脑区GABA传递改善雄性Cntnap4基因敲除小鼠的社交和恐惧记忆处理缺陷。

首先通过行为学发现：Cntnap4-/-雄鼠在旷场实验中的移动总距离显著减少，社交接触测试(Social interaction test-SIT)显示其在社交区域内停留时间减少；分区社交接触检测(Social partition test)和三箱社交结果显示其与陌生鼠的互动时间减少；条件性恐惧测试结果显示其在警报声下的僵直时间减少。上述结果证明Cntnap4-/-雄鼠表现出显著的社交和恐惧记忆处理缺陷。

BLA-PFC环路在恐惧记忆中起重要作用，课题组对Cntnap4-/-雄性鼠BLA的锥体神经元进行电生理记录，结果显示其BLA锥体神经元的sIPSC振幅显著降低，提示BLA的GABA传递受损。转录组学分析结果发现Cntnap4-/-鼠中下调的基因主要与GABA传递有关。免疫印迹结果进一步验证Cntnap4-/-雄性鼠BLA脑区中GABA受体表达异常。以上结果表明：Cntnap4基因缺陷影响雄性小鼠BLA的GABA传递进而诱导ASD样表型。

肠道菌群分析结果显示：与WT小鼠相比，Cntnap4-/-小鼠罗伊氏乳杆菌和唾液乳杆菌显著减少。在持续四周的口服罗伊氏乳杆菌后，Cntnap4-/-小鼠的社交障碍和恐惧记忆缺陷被显著逆转，其BLA的GABA传递障碍也在一定程度上被缓解。此外，移植WT鼠的粪便微生物群也可以恢复Cntnap4-/-小鼠的恐惧记忆和社交缺陷，并缓解BLA脑区的GABA传递。

本文联合行为学检测、电生理学实验、RNA-seq分析和肠道菌群移植等技术，发现Cntnap4基因缺陷导致肠道微生物菌群失调，损害BLA脑区的GABA传递并引发ASD样社交和恐惧记忆缺陷；而罗伊氏乳杆菌的口服给药或正常个体的粪便微生物群移植可以显著缓解上述缺陷。综上所述，该研究提示罗伊氏乳杆菌的补充治疗在改善ASD方面的应用潜力。

广州医科大学张文龙博士后、黄洁博士、高峰博士后、尤强龙博士后为论文共同第一作者，张云龙教授为本文通讯作者，孙向东教授提供大力支持。

参考文献：

1. Zwaigenbaum L, Penner M. Autism spectrum disorder: advances in diagnosis and evaluation. BMJ2018, 361: k1674.

2. Karayannis T, Au E, Patel JC, Kruglikov I, Markx S, Delorme R, et al. Cntnap4 differentially contributes to GABAergic and dopaminergic synaptic transmission. Nature2014, 511(7508): 236-240.

3. Zhang W, Zhou M, Lu W, Gong J, Gao F, Li Y, et al. CNTNAP4 deficiency in dopaminergic neurons initiates parkinsonian phenotypes. Theranostics2020, 10(7): 3000-3021.