快报 | 毒素-抗毒素系统改变耻垢分枝杆菌对环境胁迫的适应

作者：张蓝月，王春亮，闫玫漪，耿艺漫，殷翰，贾红彦，朱传智，李自慧，任改仙，潘丽萍，孙义成，张宗德

第一作者及单位：张蓝月，首都医科大学附属北京胸科医院，北京市结核病胸部肿瘤研究所，耐药结核病研究北京市重点实验室；王春亮，中国医学科学院北京协和医学院病原生物学研究所，病原生物学重点实验室

通信作者及单位：潘丽萍，张宗德，首都医科大学附属北京胸科医院，北京市结核病胸部肿瘤研究所，耐药结核病研究北京市重点实验室；孙义成，中国医学科学院北京协和医学院病原生物学研究所，病原生物学重点实验室

Toxin-antitoxin systems alter adaptation of Mycobacterium Smegmatis to environmental stress

Zhang LY，Wang CL，Yan MY，Geng YM，Yin H，Jia HY，Zhu CZ，Li ZH，Ren GX，Pan LP，Sun YC，Zhang ZD.

Microbiol Spectr，2022：e0281522.

doi: 10.1128/spectrum.02815-22. 

PMID: 36318013 

研究背景

毒素-抗毒素（TA）系统广泛存在于原核生物基因组中，包括细菌和古细菌。根据抗毒素灭活毒素的机制，TA模块被分为七类，即I至VII型。TA系统参与维持质粒稳定性、细菌持久性、生物膜动力学、抗噬菌体感染和基因表达的调节。然而，TA对细菌的益处尚不清楚，因为TA基因座的缺失通常对细菌的适应性没有影响。此外，大肠埃希菌、肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和恶臭假单胞菌中多个TA的缺失可能不会改变病原体对环境压力或药物的抵抗力。相比之下，几项研究也表明，多种TA系统协同改变细菌的应激耐受性。例如，MazF3、MazF6和MazF9的缺失损害了暴露于氧化应激和营养限制条件下的结核分枝杆菌的存活。3个TA基因座相继缺失后，耻垢分枝杆菌无法在复杂培养基中存活，这进一步说明病原体可能需要多个TA系统来适应复杂环境。

结核分枝杆菌（M. tuberculosis）是结核病（TB）的病原体，编码至少93个TA系统。多种TA系统可在不同条件下表达，导致抑菌和转录重编程。VapC22系统的过度表达导致转录组改变，与M. tuberculosis暴露于营养限制和低氧条件时观察到的转录组相似。此外，几种毒素的过度表达导致形态变化和生长停滞，这可能促进药物耐受。据报道，VapC4的过表达模拟了M. tuberculosis中的氨基酸饥饿，激活了氧化和铜应激反应。尽管对TA在M. tuberculosis中的功能进行了多项研究，但关于TA在抵抗环境压力中的作用的数据仍然很少。

研究方法

本文选择使用非致病性耻垢分枝杆菌（M.Smegmatis）作为研究对象（易于操作且翻代时间短）。首先，应用CRISPR基因编辑技术连续敲除M. Smegmatis mc2155染色体编码的8个假定TA。检测Δ8TA菌株在抵抗营养匮乏、氧化应激、药物处理和噬菌体感染的能力。随后，在Δ8TA菌株中表达每一对功能性TA并分析其在抵抗环境胁迫中的能力。最后，通过转录组测序分析MazEF在抵抗营养匮乏、药物耐受和噬菌体感染的具体机制。

研究结果

一、假定TA系统的实验确认

Rv0207c-0208c是Ms0251-0252的同源物，是结核分枝杆菌中预测的TA系统。为了验证Ms0251-0252是否是一个功能性TA系统（图1A），将毒素编码基因Ms0251克隆到无水四环素（ATc）的诱导载体中, Ms0251的诱导表达抑制了M.smigmats的生长（图1B），这种抑制可以通过共表达抗毒素Ms0252来挽救。这些结果表明Ms0251-0252作为TA发挥作用，表明M.smegmats 编码至少6个功能性TA模块（图1A）。

图1  耻垢分枝杆菌中的毒素-抗毒素系统。

（A） 耻垢分枝杆菌mc2155基因组中八个假定TA对的基因组图谱。（B） 不同TA基因诱导表达的耻垢分枝杆菌生长曲线。

二、八个TA缺失突变体的表型分析

为了确定多个TA系统的适应性成本，从M.smegmatis mc2155染色体上顺序删除了8个假定的TA位点。研究表明，Δ8TA和野生型菌株在7H9和LB-T复杂培养基中的细胞存活没有显著差异（图2A和B）。然而，在PBS-T营养匮乏培养基中观察到明显的存活缺陷（图2C）。在7H9和Sauton培养基中，Δ8TA菌株对200mg/mL链霉素更敏感，对5%H2O2氧化应激和16mg/mL异烟肼更耐受（图2D和E）。此外，Δ8TA菌株比野生型菌株更容易被噬菌体D29和TM4杀死，这一表型在Sauton固体培养基中进一步增强（图2F）。噬菌体敏感性的这种介质依赖性差异可以通过TA系统在不同培养条件下的差异表达来解释。综上所述，我们的结果表明，TA在对环境应激、药物暴露和噬菌体感染的抵抗中起着重要而不同的作用。

图2  野生型和Δ 8TA菌株对应激条件的敏感性。

（A至C）在7H9（A）、LB-T复杂培养基（B）和PBS-T营养匮乏培养基（C）中培养30天。（D和E） 不同压力刺激后野生型和Δ8TA菌株的敏感性测定。（F）在7H10或Sauton固体培养基中进行噬菌斑分析。

三、TA编码的蛋白质在不同的应激条件下有不同的功能

Ms4448-4447和Ms5634-5635在抵抗饥饿中起着重要作用（图3A）。在7H10和Sauton固体培养基中，Ms0251-0252的表达增加了对H2O2和INH的敏感性，但增加了对链霉素的抗性。在7H10培养基中，Ms1278-1277或Ms4448-4447的表达降低了对SDS和H2O2处理的抗性，但增加了对INH处理的抗性。有趣的是，Ms5634-5635的表达显著降低了INH耐药性（图3B），表明TA模块不仅导致耐药性增加，而且降低了耐药性。Ms4448-4447的表达略微增加了7H10平板上对噬菌体感染的抗性，并大大增强了Sauton培养基平板上对噬菌体感染的抗性（图3C）。综上所述，这些结果表明TA系统在暴露于各种压力条件下执行不同的功能。

图3 TA系统在暴露于应力条件下执行不同的功能。

（A） 在PBS-T培养基中生长10天并计数CFU。（B）不同压力刺激后野生型，Δ8TA和TA表达菌株的敏感性测定。（C）Δ8TA和TA表达菌株在7H10或Sauton固体培养基上进行噬菌斑分析。

四、转录组分析揭示了MazEF在铁代谢中的作用

我们发现在MazEF表达后408个基因的转录显著不同，其中129个被诱导，279个被抑制，这表明，MazEF的表达改变了约10%的M.smigmatis基因组（图4A）。通过实时定量PCR（qRT-PCR）进一步验证了五个高度上调和三个下调基因的差异表达，这证实了mRNA水平的变化与RNA测序（RNA-seq）所见的变化相当（图4B）。接下来，我们根据Mycobrowser提供的功能分类对这些差异表达的基因进行了注释(https://mycobrowser.epfl.ch/)。我们在MazEF表达后上调4.0倍的基因中发现了Mbt基因簇，这些基因编码“铁载体基团非核糖体肽生物合成”途径的关键成分，该途径负责合成铁螯合铁载体。此外，除其他铁调节基因外，参与铁获取、运输和储存的基因在MazEF表达下也被上调（图4C）。为了进一步表征MazEF在铁获取中的作用，我们分析了在限铁的环境中M.smegmatis菌株的生长（图4D）。MazEF在限铁的环境中强烈抑制了M.smegmatis的生长，但不影响细菌在富铁培养基中的生长。这些结果表明，MazEF调节了M.smegmatis中的铁代谢。

图4 MazEF表达对耻垢分枝杆菌Δ8TA菌株转录组的影响。

（A）火山图显示了在Δ8TA菌株中表达MazEF后的差异基因。（B）通过RNA-seq和qRT-PCR测定MazEF表达菌株中差异表达基因的比较分析。（C）热图显示MazEF表达后铁调节基因表达水平的倍数变化。（D）限铁环境中表达MazEF菌株的生长曲线。

研究结论

本研究首次系统地破译所有TA系统在耻垢分枝杆菌中的作用，为阐明TA在抵抗各种环境压力、药物耐受性和抵抗结核分枝杆菌噬菌体感染方面的作用提供有用的见解。不同的TA模块可能发挥不同的作用和协调作用，以使耻垢分枝杆菌适应不断变化的环境条件。此外，本研究中产生的8个TA缺失突变体可能为研究结核分枝杆菌中TA的功能提供了分子框架。

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编辑：王   然   

审校：郭   萌

发布日期：2022-11-22