下一代新型ADC: 点击化学ADC

清风 | 作 者

生物制药小编 | 来 源

Dara | 编 辑

目前，临床上使用的ADC在大多数情况下依赖于有效的内化和细胞内溶酶体的转运，以实现连接子的生物切割，从而释放药物。此外，被切割后的药物必须从溶酶体中逃脱，才能达到其治疗效果。

然而，并不是所有的肿瘤抗原都能确保上述有效的ADC处理，特别是在实体瘤中，而且目前内化的ADC对获得性肿瘤耐药机制也很敏感。肿瘤微环境 (TME) 中的胞外 ADC 裂解可以作为传统ADC的有价值的替代方案。在这种情况下，一旦药物释放则可以被动地扩散到肿瘤块中，穿透并杀死邻近的抗原阴性的肿瘤细胞，从而最大限度地发挥“旁观者效应”。

TME在实体瘤中的特异性靶向可以通过使用大量和选择性地存在于细胞膜上的弱的或非内化的抗原(例如CAIX、VEGFR、钙粘附素)、细胞外基质的成分(例如纤连蛋白和Tenascin-C的剪接变体、纤维蛋白、IV型胶原、αvβ3整合素)或由TME中的肿瘤细胞分泌的蛋白质(例如VEGF)来实现。如果药物能够选择性地从TME中释放，所有这些将是ADC治疗的极佳靶点。

已经发现基于二硫化物或多肽的连接子针对非内化肿瘤靶点的生物可切割ADC的显著治疗效果。含有二硫键的连接子的胞外裂解被认为是由于死亡细胞释放还原剂(如谷胱甘肽)，导致更多的细胞死亡，从而释放更多的还原剂。

此外，肿瘤细胞外参与肿瘤血管生成、侵袭和转移的蛋白水解酶(如组织蛋白、基质金属蛋白酶和尿激酶型纤溶酶原)水平升高，靶向TME中肿瘤细胞外部的非内化抗原蛋白酶敏感的ADC在几种小鼠异种移植模型中也被证明有效。然而，与细胞内的生物切割相比，细胞外的生物切割不是普遍存在的，而且效率较低。

因而最近研究人员探索了ADC连接子被化学触发的方法(图1)。在这种方法中，ADC与细胞外肿瘤靶点结合，并且未结合的ADC从血液中清除后，然后静脉注射外源化学探针(激活剂)，在与ADC连接子选择性和快速反应时进而释放药物，从而绕过对肿瘤生物学的依赖来释放药物。

由于ADC的高抗原密度和激活剂典型的快速药代动力学，体内试剂浓度和反应时间都很低，因此这种方法需要使用快速和高选择性反应，例如生物正交。  
 

图1. 点击化学ADC机制示意图

01 经典点击释放反应IEDDA哒嗪消除正交裂解反应

反式-环辛烯 (TCO) 和四嗪之间的逆电子需求 Diels-Alder (IEDDA) 反应是最快的生物正交化学反应，该反应是哒嗪消除正交裂解反应的基础。它在TCO烯丙基位置上引入氨基甲酸酯连接的有效载荷。 在第一步(点击)中，TCO和1，2，4，5-四嗪衍生物(激活剂) 做出快速而有选择的反应，产生几种DHP互变异构体。然后1，4-DHP异构体在第二步电子级联消除中快速释放含胺的有效载荷和二氧化碳（图2）。

图2. IEDDA哒嗪消除MOA示意图

四嗪触发的哒嗪消除是稳健且广泛适用的，具有良好的 TCO 连接子和四嗪激活剂稳定性，同时在体外和体内具有快速和高产的释放。使用嵌入 ADC 的可裂解连接子中的 TCO 的一个缺点是，与用于生物偶联的典型 TCO 相比，由于烯丙基取代基的空间位阻，对四嗪的反应性降低。 为了进一步提高点击反应性，潜在地降低体内剂量水平，开发了一种新的点击释放策略，仍然基于TCO和四嗪之间强大的哒嗪消除反应，但使用TCO作为激活剂，并将四嗪嵌入连接子(图3)。在这样的系统中，可以使用sTCO的衍生物来释放有效载荷，其相对于四嗪触发的哒嗪消除，点击反应性提高了三个数量级。

图3.从四嗪触发的药物释放转变为TCO触发的药物释放，以提高点击反应性

02 点击化学ADC的应用

第一个点击可切割的ADC是基于带有TCO-Dox的CC49单抗（DAR约为2），靶向非内化的肿瘤抗原TAG72(图4)。该ADC是非常稳定的，在荷瘤小鼠中显示出和亲本CC49抗体相似的PK特性。然而激活剂的低点击结合反应限制了其进一步应用。

图4. 基于抗TAG72(CC49)抗体与阿霉素偶联的第一代点击切割ADC

第二代可点击切割的ADC，选择了具有较短半衰期的TAG72靶向Diabody。 这种Diabody与TCO连接的MMAE有效载荷，通过PEG连接子连接到工程化的Cys 残基上，从而产生了一个点击切割的ADC（tc-ADC）(图5)。其具有高肿瘤摄取，并在血液和其他非靶组织中的水平非常低。通过小鼠体内进行药代动力学研究，在ADC和激活剂给药之间选择两天的间隔，因为此时ADC从血液中几乎完全清除。 对于激活剂，开发了一个小分子，含有一个高释放的3，6-双烷基四嗪基序和一个调节清除的PEG11-DOTA，当用量为0.33 mmol/kg，即可与肿瘤结合的TCO发生完全反应。

图5. 第二代可点击切割的ADC (tc-ADC) 这种新的点击可切割ADC(tc-ADC)与非结合ADC(nb-ADC)和vc连接MMAE制备的

vc-ADC在过表达TAG72的结直肠癌(LS174T)和卵巢癌(OVCAR-3)模型中进行了比较了评估。研究发现，点击化学tc-ADC处理的小鼠耐受性良好，没有明显的毒性迹象。小鼠在两周内接受四个周期的tc-ADC和激活剂治疗后，肿瘤显着且持久地消退，而vc-ADC只显示了有限的治疗效果（图 6）。

图6.tc-ADC对卵巢癌(OVCAR-3)小鼠模型的治疗效果

除了哒嗪消除反应外，还探索了其他一些生物正交切反应在ADC中的应用。 最近，Chen研究小组着手建立了基于金属的生物正交切反应转化为连接子切割反应。这些切割反应的速度可以与哒嗪消除反应一样快，甚至更快。为此，该小组对24种不同的含有铜、钯、钌、镍、钴和铁的物种进行了系统的调查，在所有被测试的化合物中，铜(I) complexes对含有炔丙氧基乙酰或炔丙基官能团的连接子显示出有效和快速地裂解，并释放含胺或含酚的有效载荷。 新开发的含有炔丙基的连接子被用来将Dox或etoposide偶联在抗HER2 抗体上(图7)。这些ADC被证明在铜(I)-BTTAA作为化学激活剂的存在下释放药物并在体外杀死HER2过表达的细胞。然而，铜(I)络合物在体内的潜在毒性以及在生物环境中随着时间的推移而不稳定，因而基于金属的生物正交点击ADC具有一定的安全风险。

图7. 含有炔丙基的连接子将Dox或etoposide偶联在HER2

抗体的点击化学ADC Liu研究小组开发了一种生物正交切割反应，该反应源于有机去保护反应，而不是点击连接反应。该小组合成了一种包含邻位氨基甲酰亚甲基硅基-酚醚体系的芳香族连接子，并使用氟化物或氟化物转移剂去除硅基，随后进行电子重排，导致含有氨基的有效载荷和二氧化碳的释放。 在PBS中，在三氟硼苯丙氨酸(Phe-BF3)的存在下，24 h内释放了90%的有效载荷，而在过氧化氢、谷胱甘肽、半胱氨酸存在下，只观察到很少的有效载荷释放。Phe-BF3模拟天然苯丙氨酸，并通过LAT-1被肿瘤细胞主动摄取。因此该研究小组开发了一种含有叔丁基二甲基硅基官能化苯酚(TBSO)的连接子，并用它将曲妥珠单抗连接到MMAE上，从而获得了一种化学上可切割的内化ADC(图8)。 在HER2阳性胃癌移植瘤(BGC823)的概念验证研究中，证实了MMAE的释放。其中先是4.5 mpk ADC给药，然后在48和96 h后给与15 mg/ kg Phe-BF3。质谱 (MS) 分析证实，相比对照组，在注射了 ADC 和激活剂的小鼠的肿瘤中存在大量游离 的MMAE。

图8. 含有TBSO的连接子将曲妥珠单抗连接到MMAE上的点击化学ADC

小结

点击化学反应具有很大的应用潜力。点击化学ADC可以不依赖于肿瘤生物学来激活它们，因而允许将范围扩大到非内吞的癌症靶点，并通过选择适当的有效载荷获得更强的旁观者效应。在异质性的实体肿瘤中，细胞外切割可能提供更均匀的药物分布，从而增加治疗效果。然而点击化学反应的临床应用对试剂的安全性和足够的体内稳定性和反应性提出了很高的要求。到目前为止，只有Tagworks开发的哒嗪消除反应被证明具有临床潜力。但相信随着技术的积累以及成熟，新一代点击化学ADC有望在患者群体中得到更广泛的应用。

参考文献

1. Chemical Linkers in Antibody–Drug Conjugates (ADCs).

2. Triggered drug release from an antibody–drug conjugate using fast “click-to-release” chemistry in mice.

3. Chemically triggered drug release from an antibody-drug conjugate leads to potent antitumour activity in mice.

4. A bioorthogonal system reveals antitumour immune function of pyroptosis.

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