具有更好临床相关性的肿瘤小鼠模型： PDX模型

在最近一个世纪，小鼠被广泛应用于生物学研究，并作为癌症模型为癌症治疗的进步做出了重大贡献(图1)。癌症模型的评估和分类使科学家对肿瘤的潜在遗传机制有了深入的了解，具有临床预测特性的小鼠动物模型可将候选药物从临床前阶段推进到临床阶段。然而，成功通过临床前研究的药物中，超过90%药物在人体阶段无效。这些数据表明，传统的临床前模型，如单层细胞系培养或同种和异种移植模型，无法很好的在人身上进行临床转化，这成为了大多数抗肿瘤药物在人身上失败的主要原因之一。

图1. 癌症动物模型时间线

近年来，动物模型在某些方面进行了改造，以提高临床翻译价值。其中一种方法是创建人源化的小鼠模型。该模型主要代表之一是创建患者衍生的异种移植(PDX)模型。在最近的几年里，研究评估了化疗在这些模型的准确性，并发现在大多数情况下，PDX模型的化疗反应与患者之间存在显著相关性。此外，PDX模型具出显著的异质性，很好的反应了其亲代肿瘤在遗传和功能水平上的特征。因此，由于其具有良好的临床上的相关性，近些年被广泛应用。本文就PDX模型做一个简要介绍。

PDX的生成过程

PDX可以通过将患者肿瘤中的癌症组织直接移植到免疫缺陷小鼠体内而产生。几种类型的此类小鼠可用于建立 PDX 模型（表1）：裸鼠，缺乏胸腺，不能产生T细胞；NOD-SCID和SCID-beige小鼠，缺乏功能性T、B和NK细胞；NOD-SCID IL2RGamma null(NOD-SCID Gamma，NSG)小鼠，其NK细胞活性完全缺失。其中NOD-SCID和NSG小鼠，可以大大提高异种移植的效率，因此是PDX小鼠模型的理想来源。

表1. PDX免疫缺陷小鼠品系的优缺点

PDX有两种不同的来源材料。一种是单细胞悬液，一种是组织碎片。植入性肿瘤通常是在患者接受手术时获得的。癌灶先在装满培养液的试管中交给病理学家或研究人员。之后，切除坏死组织，并将肿瘤切成小的碎片或进行化学消化或物理处理成单细胞悬浮液。离散的肿瘤碎片或使用单细胞悬液构建PDX模型各有优缺点。肿瘤碎片保留了原始肿瘤的细胞间相互作用和一些组织结构，因此模拟了肿瘤的微环境。而单细胞悬液能够收集整个肿瘤的无偏样本，避免在分析或肿瘤传代过程中无意富集某些亚克隆。然而，单细胞悬浮液使肿瘤细胞在受到化学或机械力后，可能会引发细胞凋亡，从而影响细胞活性和植入的成功率。

与使用肿瘤细胞系开发的异种移植模型不同， PDX模型中肿瘤可以从患者身上获得后立即植入，而不需要任何培养。为了便于移植，肿瘤碎片切成2-3 mm3 (图2)，然后肿瘤碎片被异位或原位移植到小鼠身上。接受患者肿瘤碎片的第一代小鼠通常被标记为F0。当肿瘤达到足够大小时，它会被解剖并重新植入其他小鼠体内。此后的每一代表示为F1、F2、F3、...和Fn。对于药物开发，在确保PDX没有遗传或组织学上偏离原始肿瘤后，可以使用F3代以上的PDX。

图2. PDX模型的制作流程

影响PDX模型植入成功率的因素

一些公司已经将几乎所有癌症类型的PDX模型商业化。根据癌症类型的不同，异种移植的成功率也不同。一些肿瘤模型的PDX植入成功率和具体植入方法见表2。

表2. 不同部位、不同品系移植的不同类型肿瘤的PDX成功率

PDX的成功率受多种因素的影响。首先，原发肿瘤的特征，包括肿瘤的侵袭性、组织学类型、肿瘤细胞在组织中所占比例是极其重要的。例如，在乳腺癌中，三阴性乳腺癌的成功率高于其他组织类型，如ER阳性或HER2阳性癌症。其次，生成PDX的过程会影响成功率。组织应该尽可能新鲜，这意味着从手术室到实验室所需的时间应该最小化。此外，手术后组织需要立即保存在寒冷、新鲜的介质中。第三，植入的组织的大小和数量可能是影响成功率的重要因素。碎片数量越多，成功率越高，碎片大小应为1-2 mm3。第四，植入部位不同，成功率也不同。通常，肾被膜下植入的成功率高于皮下植入，因为肾被膜下保留了原始的肿瘤间质和宿主间质。最后，肿瘤对宿主环境的适应能力因原始肿瘤而异。能很好地适应环境而没有免疫排斥反应的肿瘤组织更有可能植入成功。

PDX模型的验证和分子分析

当移植的肿瘤达到足够大小(直径为1-2 cm)时，切取肿瘤，应尽可能切除肿瘤周围的小鼠组织。之后，用10%的福尔马林保存一部分肿瘤。为了验证PDX的组织学与原始肿瘤是否保守，从保存的组织中生成石蜡切片，并用苏木精和伊红或其他免疫组织化学标记物进行染色。

另一方面，从冰冻组织中提取的基因组DNA将用于cancer panel或全基因组测序。RNA也可被提纯，用于RNA测序或实时聚合酶链式反应，以测量特定基因的表达。如果需要检测蛋白质的表达，可以用tissue-rupter将其切碎或研磨从而从PDX组织中提取蛋白质进行鉴定。

PDX模型在肿瘤研究中的应用

药物筛选与生物标记物开发

PDX临床试验(PCT)对人类临床试验前的临床决策和药物的开发具有重要意义。PCT类似II期临床试验模型。2015年Gao设计了一种高通量的体内药物筛选方法“1×1×1”，即利用大量的PDX模型，每个治疗组每个模型一个动物。然而，每个治疗组的每个模型两到三只动物的PDX临床试验(2×1×1或3×1×1)最近变得更加常见，因为其更能代表药物的反应(图3)。

图3. PDX临床试验方法

在乳腺癌、肾细胞癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌和结直肠癌中使用PDX模型的几项研究表明，PDX模型的药物应答率与临床观察到的药物应答率相关。例如，在肾癌中，PDX模型对雷帕霉素、舒尼替尼和多韦替尼有效，但对厄洛替尼无效，这与临床数据相同。此外，表皮生长因子受体抑制剂西妥昔单抗在PDX模型中的有效率与临床结果完全一致。在常规化疗方面，对非小细胞肺癌、乳腺癌、结直肠癌和胰腺导管腺癌的研究表明，临床使用的药物如紫杉醇、卡铂、吉西他滨、5-氟尿嘧啶、伊立替康和阿霉素在PDX模型中与临床中的有效率相似。一项针对胰腺癌的前瞻性研究显示，可以将PDX模型用作临床试验的潜在筛查平台。在PDX模型中，二甲双胍治疗不能抑制胰腺癌的生长。临床试验也显示，在针对局部晚期和转移性胰腺癌的联合治疗方案中加入二甲双胍没有任何益处。因此，使用PDX模型进行临床前试验可以节省临床试验所需的时间和资源。 关于生物标记物的发现，PDX模型与人体试验的一致性使得能够发现药物敏感性和耐药性的生物标记物。此外，药物疗效和分子遗传特征之间的关系可以利用异质PDX模型来研究。例如，Sebastiani等人用PDX胰腺癌模型揭示了吉西他滨耐药和生存的分子机制的关系。PDX模型也是产生耐药肿瘤模型的宝贵工具。Das Thakur等人使用PDX建立了维莫非尼耐药黑色素瘤模型。研究发现，通过持续的药物治疗，突变的BRAF蛋白升高，这种突变已被证明确实是维莫拉非尼耐药的关键因素。

Co-clinical试验

PDX模型加速了药物的开发和临床试验的阶段。目前，PDX模型的预测可用于co-clinical试验。使用PDX模型的co-clinical试验方法有助于确定最佳药物的优先顺序，促进对受试者的快速分类，确定生物标记物，并检测耐药性机制。这种形式的试验正在对一些癌症进行研究，如肉瘤和各种实体瘤(图4)。

图4. Co-clinical试验

个性化精准医学

对癌症基因和表型认识的提高，导致了精准医学的新纪元，即“在正确的时间，针对正确的患者，使用正确的药物”。精准医学是基于复杂的基因组图谱将患者分组为亚群，使某些疗法能够针对特定的亚群进行精准的治疗，以最大限度地提高治疗效果并将副作用降至最低。基于这一概念，PDX是一个合适的模型，因为它保留了单个肿瘤的基因组特征，并代表了具有相似遗传特征的亚组。 例如，一份报告使用PDX模型描绘了胰腺癌的个性化治疗。在这项研究中，患者肿瘤的exom测序揭示了多个保守的遗传改变。此外，使用NGS，从PDX模型获得基于阵列的基因组杂交比较数据，可以对晚期乳腺癌进行基因组信息驱动的精准治疗。 总之，使用PDX模型进行个性化精准治疗已经在各种癌症中进行研究，并且随着NGS和生物信息学技术的进步，将会积累大量得数据（图5）。 

图5. 使用PDX模型建立个性化药物的流程图

免疫疗法

近年来，免疫治疗在治疗各种恶性肿瘤方面取得了广泛的成功，基于异种细胞系的模型和基因工程小鼠模型(GEMM)的局限性导致研究人员越来越倾向于使用PDX模型。通过在PDX模型中重建人类免疫系统并创建人源化模型，科学家们将能够对免疫治疗疗效进行评估。这些人源化模型目前已被用于评估多种免疫疗法，如ICIs、CAR-T、TIL疗法（图6）。 

图6. 人源化PDX模型在免疫治疗中的应用

小结   

PDX模型是临床前研究中最可靠和最标准的模型之一。虽然这些模型和其他模型一样有局限性，但它保持了原发肿瘤的特性。这种模型在药物筛选、生物标记物开发和co-clinical的临床前试验中具有许多优势。随着NGS和其他组学技术的进步，我们有可能获得每个患者肿瘤的全面分子标记。我们相信，PDX模型未来将是拓宽个性化精准医疗策略的最合适的临床前工具之一。