钙化性纳米颗粒/纳米细菌与肾结石

[背景]钙化性纳米颗粒（CNPS）是一种磷酸钙和蛋白质共同形成的纳米大小的球形复合物，具有自我复制的功能，曾被称为“纳米细菌”。然而在其被发现27年后，它们的性质仍未完全确定，到目前为止，没有人能够确定它们是否是地球上最小的能够自我复制的生命形式，抑或简单的蛋白质一矿物质组合体。同时，由于这些生物体主要从泌尿生殖道被分离出来，因此，越来越多的研究关注了这种颗粒在泌尿系统疾病病因学中所发挥的作用。

1990年芬兰科学家Kajander发现，在培养的哺乳类动物细胞内存在着一种体积很小的原核微生物，它可以引起细胞的空泡样变性和坏死。据认为，该微生物来源于细胞培养所需的胎牛血清。由于这种微生物的体积很小，将其命名为纳米细菌(Nanobacteria)。

纳米细菌这个术语最初是用来描述来自于火星标本上地质陨石以及基于形态学上方面地球上的活体生物的矿物沉淀物和目标体。纳米细菌可以只有50纳米，或百万分之一毫米。一些科学家已从南极和海底的冰块中设别出纳米细菌。这种生物的形态为卵球形，外周包裹了一层矿物质。X射线偏振显微分析提示碳酸磷灰石。它们的直径为0.08–0.5υm,因此可以通过大多数的生物滤膜，并被认定为可滤过的细菌。

尽管DNA基因序列分析表明纳米细菌与蛋白细菌家族a2亚群的布鲁氏菌、巴尔通菌同属，均具有相同的16srRNA片段。最近Kajander指出，由于对纳米细菌16SrRNA的检测结果并没有取得一致的意见，因此，关于纳米细菌的本质和分类目前仍存在着争议。与其称这种生物体为纳米细菌，不如称其为钙化性纳米微粒(Calcifyingnanoparticles，CNP)。早在1998年美国国家科学院的一次会议上，就认为纳米细菌由于体积太小，以至于不能想象它可以是有生命的活体。近年来，随着人们对钙化性纳米微粒认识的不断提高，关于钙化性纳米微粒本质的争论也正在不断地升级。争论的主要焦点集中于钙化性纳米微粒是否是一种独立存在的生物体的问题。

尽管已从肾结石标本中成功地分离出钙化性纳米微粒以及与它相关的蛋白质、脱氧核糖核酸。但是免疫印迹分析表明，Kajander等研制的钙化性纳米微粒特异性单克隆抗体实际上也与血清中的白蛋白发生反应，并不存在特异性。因此，这个抗体不能作为有生命活性的微生物的生物性标记。Martel等报道，来源于人体血液的钙化性纳米微粒并没有通过PCR的扩增方法获得它的16SrDNA。而在体外配制的碳酸钙却与钙化性纳米微粒在大小、形态和以及聚集的方式很相像。这些碳酸钙球体的大小和形态的改变会受到不同比例的CO2和NaHCO3等因素所影响。因此，推测钙化性纳米微粒实际上仅仅是无生命的碳酸盐球体而己。

     目前的证据尚不能说明钙化性纳米微粒就是生物体内的病理学钙化或肾Randall斑的起源。钙化性纳米微粒从体积的大小到生物矿化的特性都与传统概念中的微生物有着极大的不同。迄今为止,研究者不能确定钙化性纳米微粒是否具有生命的活性。在人体多种的病理性钙化疾病的病灶中都发现了钙化性纳米微粒存在，并且在体外也能复制出其致结石的模型，这表明钙化性纳米微粒极有可能参与了体内病理性钙化的整个过程。

研究显示钙化性纳米微粒为革兰氏染色阴性，直径50-500nm，呈球形或椭球形，无荚膜和鞭毛，扫描电镜下其大小和形态与肾结石中最小的磷灰石单元非常类似。一项关于纳米细菌是否为生命的更有力的否定证据为对牙菌斑的研究。纳米细菌已经被假设与牙菌斑有关。这些研究能够说明在无菌培养接种的人类唾液中的矿化作用。对牙菌斑膜滤过物的提取并培养3周。运用透射电子显微术可见为球菌样颗粒与纳米细菌形态相同。然而，DNA和核酸染色没有特殊性。可以认为是阴性。矿化作用在90度时没有被抑制或者被呼吸抑制剂-三氮化钠所抑制。

钙化性纳米微粒CNP的生长繁殖比较缓慢，在pH值7. 4并且含有100 ml/L胎牛血清和适量谷氨酞胺的细胞培养基中，平均倍增时间为3d；而在无血清的细胞培养基中，其增殖速度变慢，它的倍增时间可延长至5-6d。进入生物体内的钙化性纳米微粒可以经过胆汁和尿液途径排泄到体外。Akerman等用99mT C标记钙化性纳米微粒后，经耳缘静脉注射到实验兔体内，观察到肾脏有很高的放射活性，15分钟内即出现在尿液中。在不同的培养条件下，钙化性纳米微粒CNP的形态也有所不同。在有抗生素的环境中，它可以形成厚厚的生物膜，当血清蛋白的浓度降至5%以下时，其外壳的钙化增多，而在微重力的条件下，其外壳的钙化减少。尽管如此，钙化性纳米微粒的抗原性并没有发生改变，仍然可被特异性单克隆抗体所识别。

应用γ射线照射钙化性纳米微粒CNP后，CNP的生长可以被抑制这是作为一项证据来表明CNP并不是一个简单的非生命的矿化现象。结合甲硫氨酸和尿核甙的放射标记可分别标记CNP的蛋白和DNA的合成。此外CNP的生长可以被多种抗生素所抑制，如四环素（与磷灰石相结合）作为二碳磷酸盐化合物可以与羟基磷灰石晶体相结合，从而阻止结石的生长和聚集。5-氟脲嘧啶可以抑制CNP的DNA和RNA的合成和进展，这似乎间接提示有活体生物的存在。也许四环素或5-氟脲嘧啶并不是单纯对再生有机物的抑制，而是对结晶形成和聚集的抑制。钙化性纳米微粒在其外周形成坚硬的矿化外壳，利用红外光谱法检测证实此矿化外壳的主要成分为碳酸羟基磷灰石。由于血清中含有诸如骨桥蛋白、降钙素、胎球蛋白等抑制磷灰石形成的生物因子，因此在钙化性纳米微粒CNP己经形成的矿化物中加入胎牛血清以后，这些矿化物的形成可以受到抑制，或者出现矿化物溶解的现象。

钙化性纳米微粒CNP诱导肾结石形成的途径可能为:(1)CNP本身可能直接引起肾小管上皮细胞内外的结晶沉淀，导致上皮的毒性损伤，从而诱导草酸钙或者磷酸钙在其表面沉着，进一步形成所谓的Randall斑，最终导致结石的形成。(2)钙化性纳米微粒经尿液排泄，并定位于肾小管上皮细胞，诱导肾小管细胞外矿化，在细胞的表而产牛牛物源性磷灰石，从而介导以磷灰石为核心的草酸钙结石的形成。基于以下证据认为纳米细菌是肾结石形成因素。这个理论认为纳米细菌在其表面可形成碳酸磷灰石核，因此为结石形成提供了巢, 许多证据表明，磷酸钙更可能是草酸钙结石形成的始动力量。而纳米细菌又是始动的源头刺激巢核形成。纳米细菌已经在人类血液中和牛胎血的标本中被识别。被放射标记的纳米细菌可以观察到从血液到尿的运行过程。特殊的抗纳米细菌单克隆抗体在所有标本中都有应答。

Matlaga等证实Randall斑内有球形的磷酸钙沉淀成分存在。由于Randall斑的成分与钙化性纳米微粒钙化外壳的轻基磷灰石成分相同，因此，Ciftcioglu等认为钙化性纳米微粒可能是Randall斑形成的始动因素:即钙化性纳米微粒造成肾乳头和集合管的损害，加上其生物矿化作用所形成的磷酸钙结石核心的影响，介导异质成核过程，最终导致肾结石的形成。Ciftcioglu'等报道，在非结石的17例肾脏标本发现有11例出现肉眼可见的Randall斑，在这11例中有8例钙化性纳米微粒抗原检测阳性，扫描电镜和X线能谱分析(EDX)显示14例样本有球形的磷灰石形成。由此可见，钙化性纳米微粒与Randall斑的形成是有一定关联的。据推测，钙化性纳米微粒能够通过一种特殊的方式入侵哺乳动物的细胞内，从而直接引起受感染细胞的变性、坏死或者凋亡的过程。运用特异性单克隆抗体测定、异硫氰酸荧光素染色和电镜观察均能够发现钙化性纳米微粒定位于成纤维细胞的表面。因此，推测钙化性纳米微粒可能是通过受体介导的细胞胞饮作用而感染细胞，并且对细胞产生毒性作用的。

钙化性纳米微粒培养的阳性结石中，草酸钙结石是94.2%；磷酸钙结石是 81.8%；尿酸结石和胱胺酸结石以及感染性结石为100%。纳米细菌的广泛存在，尤其是钙化性纳米微粒在后三者中的普遍存在，导致人们对其重要性的疑问。磷酸钙结晶并不是胱胺酸和尿酸结石的始动因素；感染性结石已经很明确与产脲酶的细菌有关，而不需要分离的成核作用。一项有趣的钙化性纳米微粒诱导肾结石的动物模型研究：经皮肾穿刺将钙化性纳米微粒注射入4个鼠肾脏，在肾盂和肾盏中形成梗阻性结石，然而，是否注射其它的非生物的微粒可引起相似的作用并不能得到确定。这项研究并没有说明注射材料的生物性。一项阴性研究显示，4 例尿路结石中并没有发现与钙化性纳米微粒相一致的微小颗粒。然而不同染色和单克隆抗体免疫荧光不同发现纳米细菌的标记。作者也不能用Kajander and Ciftcioglu的方法从结石中生长出细菌。  

在钙化性纳米微粒感染的成纤维细胞中，通过电镜观察到细胞内外均有针尖样的晶体沉淀，Von Kossa钙染色显示其与病理性钙化中的钙化小球体极为类似。据报道，所有的病理性钙化灶都包含有大约200nm大小的雪球样的磷酸钙球体[28]。因此，有理由推测，这种磷酸钙球体可能是钙化性纳米微粒感染细胞引起的晶体沉淀，而Randall斑实际上是肾乳头尖部或其周围的间质组织中出现的结晶沉淀。从这一点看来，钙化性纳米微粒与Randall斑之间的确存在着因果关系:钙化性纳米微粒可能介导Randall斑的形成，后者的表面粘膜脱落后，与过饱和的尿液接触而最终生长并形成结石。

    Shiekh等把钙化性纳米微粒静脉注射进Wistar大鼠体内，发现大鼠的肾脏皮质和髓质组织内有炎症细胞的浸润和聚集;利用电镜可以观察到这些细菌粘附在肾小管上皮细胞表面，同时存在着被细胞内吞的现象。此外，肾小管的表面也有微小的均匀钙化斑存在。由此表明，钙化性纳米微粒是可以诱导肾小管细胞外矿化的。Cuerpo等将钙化性纳米微粒注射进大鼠的肾脏，经过一个月的追踪观察，发现该肾脏有结石的形成。因此，有理由推测钙化性纳米微粒在感染肾小管上皮细胞的同时，可能在细胞的表面产生生物源性的磷灰石，为草酸钙晶体的粘附、生长提供适当的位置;或者可能通过对肾小管上皮的毒性损伤，引起上皮的脱落，而后者可作为一个病灶，促进钙盐的沉积和结晶化的过程，最终导致结石的形成。

    虽然碳酸钙沉积在体内能导致一些疾病，但是目前有许多证据提示钙化性纳米微粒纳在体内广泛存在，并没有特别的病理变化。甚至有人认为钙化性纳米微粒可能是良性的。钙化性纳米微粒从体积的大小到生物矿化的特性都与传统概念中的微生物有着极大的不同，要深入探讨该微粒的本质，可能需要改变传统的思维模式，从一个全新的角度来分析这种微粒。

图 钙化性纳米微粒