癌症与线粒体的关系

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一. 线粒体介绍

线粒体是细胞中的“动力工厂”，为细胞提供主要的能量来源，其中我们细胞生命活动80％能量都是由线粒体提供的。线粒体形态对于细胞维持正常生理代谢和机体发育起着重要的作用，如果线粒体结构和功能发生了异常，就会导致疾病的发生。

近年来，线粒体研究已经成为生命科学及医学领域的研究热点，其中，线粒体的融合与分裂维持着线粒体正常的形态、分布和功能。线粒体融合与分裂的失衡通常与人类各种疾病，包括肿瘤的发生发展。

线粒体内有一套独立于细胞核的遗传物质——线粒体DNA（mtDNA），人类线粒体DNA的长度为16569bp，拥有37个基因，编码13种蛋白，这些蛋白都参与细胞的能量代谢。

在人类衰老和一系列疾病中，都涉及线粒体DNA（mtDNA）的表达改变，而线粒体DNA（mtDNA）的突变更是会直接导致数十种严重的遗传疾病。

二. 线粒体与癌症的关系

线粒体是母系遗传的，是起源于共生细菌的细胞器。它们与宿主共同进化，因此大多数线粒体蛋白质是核编码的。然而，线粒体保留一个小的16kb DNA基因组，编码tRNAs、rRNA和呼吸必需的蛋白质。细胞有数百个线粒体，可以是野生型的，也可以是野生型和突变型的混合物，这种状态被称为异质性。线粒体是重要的生物能量和生物合成工厂，对正常细胞功能和人类健康至关重要。人类的线粒体疾病可能是毁灭性的，影响许多组织，包括神经系统、心脏和肌肉。线粒体疾病可由病原突变线粒体基因组的母系遗传引起，这些线粒体基因组表现为高度异质性的疾病，或由必需线粒体基因的功能丧失突变的核遗传引起。

奥托·瓦尔堡的观察发现，癌症具有在氧气存在下吸收和发酵葡萄糖形成乳酸的特殊特性，这使他提出线粒体呼吸缺陷是有氧糖酵解和癌症的潜在基础。然而事实上，瓦尔堡效应只能作为FDG-PET肿瘤显像的基础，临床广泛使用，并不是所有的肿瘤都具有这种有氧糖酵解的特性。线粒体呼吸缺陷通常不是有氧糖酵解的原因，也不是肿瘤进化过程中通常选择的原因。在大多数癌症中，促进糖酵解的是致癌驱动因子突变，如K-ras、c-Myc和磷脂酰肌醇-3 (PI3)激酶的激活或磷酸酶和紧张蛋白同源物和p53的缺失，而不是失活线粒体呼吸复合体的突变。

同时，大多数癌症仍然保留线粒体功能，包括呼吸。一些肿瘤具有高水平的氧化磷酸化，而其他相对糖酵解的肿瘤仍然保留线粒体呼吸和其他功能。在培养的细胞中通过通量分析定量，发现AKT转化不显著影响呼吸作用，而Ras转化减少呼吸作用，但大部分ATP仍然通过氧化磷酸化产生。对癌症中线粒体活性需求的功能测试已经揭示了它们的重要性。线粒体转录因子Tfam的失活会耗尽肿瘤细胞中的线粒体，从而在原地模型中损害K-ras肺肿瘤的生长。通过毒害mtDNA复制产生r0细胞来耗尽肿瘤细胞的mtDNA，从而破坏肿瘤的发生。此外，mtDNA耗尽r0肿瘤生长恢复的选择与宿主组织线粒体基因组的水平转移和呼吸恢复有关。这些和其他发现表明，线粒体在癌症中的作用不像瓦尔堡想象的那么简单。相反，他们指出了线粒体功能对肿瘤生长的重要性。

三. 线粒体整合分解代谢、合成代谢和信号转导

线粒体是生物能量和生物合成的细胞器，从细胞质中吸收底物，并利用它们驱动脂肪酸氧化(FAO)、TCA循环、电子传递链(ETC)和呼吸，并合成氨基酸、脂类、核苷酸、血红素、铁硫团以及NADPH来进行自身的抗氧化防御。通过TCA循环产生的NADH和FADH2为ETC提供动力，从而在线粒体内膜上产生一个质子梯度，通过H+ -ATP合酶的作用产生ATP。二氢月牙酸脱氢酶(DHODH)是嘧啶从头合成所必需的，需要一个功能性呼吸链才能发挥活性。线粒体中产生的活性氧(ROS)是ETC的副产物，可以激活MAP激酶和hif等信号转导途径(常氧被称为假性缺氧)。过量的ROS产生也会导致细胞死亡。线粒体可以隔离Ca2+，并选择性释放Ca2+控制信号和广泛的细胞功能。

线粒体作为先天免疫的信号平台(例如，MAVS和mtDNA的释放)。位于线粒体外膜的BCL-2蛋白家族可以通过凋亡控制细胞程序性死亡。BCL-2相关的抗凋亡蛋白阻断，而BAX和BAK促凋亡蛋白促进细胞色素c从线粒体膜间隙释放。这种细胞色素c释放触发细胞溶胶中的凋亡小体和半胱天冬酶蛋白酶的激活，导致细胞死亡。因此，线粒体和细胞之间的通信协调了一系列对细胞代谢、生长和生存至关重要的功能。

除了作为生物能量的发电站和信号中枢，线粒体还作为生成生物合成基石的平台。这需要4C(四碳)单元的持续流入来平衡这些单元向氨基酸和其他生物合成产品的流出。TCA循环4C单元的补充被称为回复性，可以通过丙酮酸的羧化或谷氨酰胺和其他氨基酸的分解代谢发生。

除了提供4C单元外，还需要2C(二碳)单元，后者由可以由脂肪酸、丙酮酸、乙酸和许多氨基酸形成的乙酰辅酶a提供。图中 4C和2C的缩合反应。线粒体作为生物合成和信号枢纽TCA循环利用糖酵解、脂肪酸氧化和氨基酸分解代谢产生的底物来生成基石和高能电子(NADH和FADH2)，为ETC提供动力。阐明了线粒体产生的主要生物合成产物和线粒体功能调节的信号通路。该单位通过柠檬酸合酶产生柠檬酸，这是唯一的线粒体定位。除了作为上游前体能够生成所有经典的TCA循环中间体外，柠檬酸盐还可以输出到细胞质中，在细胞质中被分解为草酰乙酸和乙酰辅酶a，这是脂质合成和蛋白质修饰所必需的。除了4C和2C单元，线粒体还在嘌呤、胸腺嘧啶和蛋氨酸合成所需的1C(一个碳单元)代谢中发挥核心作用。

四. 癌症中的线粒体基因组

已知约100个基因的获得性核、体细胞和生殖系突变可在癌症治疗中提供选择性优势。由于DNA修复缺陷、复制错误、致癌物质暴露或衰老导致的突变频率增加，通过增加这些基因突变的发生促进癌症。这些癌症驱动突变及其对癌症生长的功能后果通常被很好地理解，并且是靶向抗癌药物开发的主题。

相比之下，线粒体基因组突变在癌症中的地位和作用就不那么清楚了。利用过去测序技术的低灵敏度来评估异质基因组的小样本量研究使得体细胞获得的线粒体基因组突变与癌症的关联不明确。此外，现在司空见惯的高级核测序研究通常忽略了线粒体基因组。最近的两项大规模研究通过大规模平行DNA测序，对来自同一患者的30多种肿瘤类型的2000多种人类癌症的线粒体基因组突变情况进行了比较，揭示了重要的观点，发现了许多具有强复制链偏倚的体细胞替换，在线粒体重链上出现“C转T”和“A转G”，表明线粒体聚合酶G错误是突变的主要原因。更重要的是，错义突变是中性的并倾向于同质，而有害的、致病的突变仍然是异质的，存在着消极选择。这些发现清楚地表明，在人类癌症中普遍存在保留线粒体基因组功能的选择压力。

五. 线粒体在癌症中的质量控制

为了让细胞正常运作，需要在线粒体和细胞核之间来回通信，这被称为顺行和逆行信号。核基因控制线粒体的生物过程，合成更多的线粒体，满足增加的代谢需求。相反的生物过程是由自噬和线粒体自噬基因控制的另一层核。

人类癌症中缺乏致病性线粒体基因组突变的积累，表明线粒体质量控制的积极机制的参与，以防止缺陷线粒体的积累。线粒体自噬是一种特殊形式的自噬，它选择性地降解和消除多余或受损的线粒体。生物过程和线粒体自噬共同调节线粒体的质量、功能和质量。反过来，有缺陷的线粒体通过膜去极化和线粒体蛋白的级联磷酸化和泛素化直接向线粒体吞噬机制提供“吃我”信号，而减少的细胞能量输出(当线粒体总数不足时发生)，通过一般能量传感器AMP激酶和其他机制触发线粒体生物过程。

线粒体外膜去极化触发激酶PINK1的激活，使泛素磷酸化，导致E3连接酶PARKIN募集到线粒体外膜。PARKIN进一步将线粒体蛋白泛素化，从而招募自噬机制来捕获、吞噬并降解溶酶体中的这些特定线粒体。其他一些与PARKIN无关的线粒体自噬受体蛋白包括BNIP3、NIX、FUNDC1和BCL2L13。尽管推测线粒体自噬在癌症中的作用是合理的，但缺乏线粒体自噬参与肿瘤发生的直接证据。线粒体质量控制在癌症中的作用主要是通过操纵真正的自噬基因的遗传模型获得的信息。

RAS驱动的癌症通过激活促进自噬和溶酶体生物发生的基本螺旋环螺旋亮氨酸拉链转录因子MiTF/TFE家族来上调基础自噬。在癌症小鼠模型中，敲除自噬必需基因产生自噬缺陷，导致缺陷线粒体和其他自噬底物的积累，损害线粒体呼吸、细胞生长和生存，同时增加细胞死亡和衰老。对已确诊为RAS驱动型肺癌的小鼠进行系统性的急性自噬消融，在对大多数正常组织产生显著损伤之前，会产生大量的肿瘤消退，这表明一些肿瘤特别依赖自噬。重要的是，与自噬完整产生的癌相比，自噬缺失肿瘤类似于良性的嗜酸细胞瘤，这是一种以缺陷线粒体积累为特征的肿瘤。因此，自噬是肿瘤从良性向恶性发展的必要条件。这也符合RAS驱动的胰腺良性病变恶性进展对自噬的要求。因此，自噬是诱导和需要克服障碍，恶性生长在多种癌症类型。

由于自噬的主要作用是控制线粒体质量，并可能为线粒体代谢提供底物，因此自噬可能通过这些机制促进肿瘤的发生和恶性肿瘤的发生。这一点缺乏直接的证明，因为自噬介导的循环提供的特定底物的身份，以及它们支持的代谢途径尚不清楚。肿瘤细胞自噬缺乏导致谷氨酰胺依赖，提示谷氨酰胺可能是自噬供给的底物。在神经元中，线粒体自噬对于去除线粒体基因组损伤中受损的线粒体蛋白非常重要。

小结：

几十年前，奥托·瓦尔堡(Otto Warburg)观察到癌症在氧气存在的情况下发酵葡萄糖，这表明线粒体呼吸的缺陷可能是癌症的潜在原因。我们现在知道，驱动异常癌细胞增殖的遗传事件也会改变生化代谢，包括促进有氧糖酵解，但通常不会损害线粒体功能。线粒体提供能量;为新细胞提供构建模块;并控制氧化还原稳态、致癌信号、先天免疫和凋亡。事实上，线粒体的生物过程和质量控制在癌症中经常被上调。虽然一些癌症具有产生致癌代谢物的核编码线粒体三羧酸(TCA)循环酶的突变，但对致病的线粒体基因组突变存在负选择。

消除mtDNA可以限制肿瘤的发生，罕见的线粒体基因组突变的人类肿瘤是相对良性的。因此，线粒体在恶性肿瘤的进展中发挥着重要的多功能作用，靶向线粒体提供了治疗的机会。

那么接下来我们将介绍一下在线粒体对于癌症的治疗中的一些研究：

1、线粒体治疗：

使用健康线粒体替代细胞内功能障碍线粒体，以用于疾病治疗的方法，被称为线粒体治疗。由于诸多疾病与线粒体障碍相关，因此线粒体治疗可能对线粒体相关疾病具有普适性。在2016年，由第三方女性提供正常线粒体的三亲婴儿出生，明确了外源线粒体移植到细胞后可行使正常功能。这种将线粒体微注射到极体或卵母细胞的方法，可用于治疗先天性的线粒体疾病。但随着年龄增长出现的线粒体疾病，则需要其他的线粒体移植途径。早年研究发现，加入到培养基中的线粒体可修复线粒体受损的细胞。我们的实验也多次证明了这个结果，并将该发现应用于向动物体内直接进行线粒体注射，以恢复受损组织的正常功能。将分离的线粒体与受体细胞共同孵育，这种技术可以很容易地应用于许多不同类型的细胞。该方法提供了研究向受体细胞内人工转移的外源线粒体的行为和作用的机会。目前该研究领域逐渐从小众走向大众，并在多种疾病的治疗中快速展开，成为治疗线粒体疾病的一个崭新的方法。

线粒体是微米级的细胞器。其进入细胞的机制可参考微纳米脂质体或胶束等进入细胞的途径。但需要指出的是，微纳米脂质体或胶束等在进入细胞后，逐渐破裂释放出所包载的药物；或者与溶酶体融合，经溶酶体酸性环境作用或经酶解，破坏外层膜，造成药物快速释放。然而，线粒体在进入细胞后，绝大部分则以完整形态发挥作用，这与微纳米载药系统不同，其机制目前尚不清楚。

1.1 线粒体经肌动蛋白依赖的途径进入细胞

线粒体加入到培养基后，可在短短10 min内进入细胞。目前常采用小分子抑制剂来研究荧光标记的线粒体进入细胞的机制，例如，秋水仙碱、细胞松弛素、阿米洛利、氯丙嗪等细胞内吞或巨胞饮抑制剂。线粒体的荧光标记方法常采用依赖于膜电位的荧光探针`和核编码的靶向线粒体的荧光蛋白等。Kesner等和Patel等的研究表明线粒体进入细胞的方式主要由巨胞饮作用介导。但Sun等和Pacak等则报道线粒体是由肌动蛋白依赖性内吞作用，而非巨胞饮作用介导的方式进入细胞。该研究分别使用细胞松弛素D用于抑制肌动蛋白聚合、使用甲基-β-环糊精阻止内吞作用，并使用诺卡多唑来阻断隧道纳米管，结果显示这些抑制剂极大地抑制了细胞对线粒体的摄取，从而推断线粒体进入细胞的途径主要是肌动蛋白依赖的内吞方式。当线粒体经内吞进入细胞后，形成的包含线粒体的微囊可能在细胞中破裂，释放出完整的线粒体发挥作用。

1.2 恶性肿瘤

恶性肿瘤和正常细胞的一个主要差别在于肿瘤细胞的代谢重编程。而肿瘤线粒体是代谢重编程的关键细胞器。恶性肿瘤细胞内的线粒体往往发生数量、结构和功能的改变，以适应肿瘤在酸性和缺氧环境中快速增长的需要。例如，肿瘤线粒体诱导细胞凋亡的能力被遏制、氧化磷酸化减弱而无氧糖酵解增强(Warburg效应)、采用截断或反向的三羧酸循环(Tricarboxylic acid cycle，TCA cycle) 生成肿瘤代谢中间产物等。因此，正常线粒体若进入恶性肿瘤细胞中，可能会产生两种不同的结果：(1) 纠正细胞代谢、扭转恶性化方向、促使肿瘤细胞向正常细胞方向转化。(2) 正常线粒体难以忍受肿瘤细胞恶劣的内环境，激活细胞凋亡途径，诱导细胞凋亡。目前的实验证据支持第2种结果。

目前线粒体已成功应用于乳腺癌、脑胶质瘤、黑色素瘤等的治疗和研究。总体结果显示，线粒体可抑制肿瘤细胞的生长增殖。Elliott等从人乳腺上皮细胞MCF-12A分离出正常功能的线粒体并进行荧光染色，线粒体与乳腺癌细胞系MCF-7、T47D和MDA-MB-231共孵育后，通过抑制肿瘤细胞糖酵解途径，使细胞增殖速度降低、乳酸生成减少，并提高了肿瘤细胞对药物的敏感性。此外，非癌细胞的线粒体进入到侵袭性的骨肉瘤细胞后，前者可逆转恶性癌细胞的致癌特性，例如降低在缺氧状态下的细胞增殖活力和侵袭能力、提高凋亡能力、降低对抗癌药的耐受性和在软琼脂中的集落形成能力。在动物体内实验中，从正常小鼠肝脏中分离的线粒体可显著抑制黑色素瘤的生长、明显延长荷瘤小鼠的生存期。其抗肿瘤机制与ATP耗竭、诱导细胞凋亡和坏死有关。另外，由于线粒体和细胞核存在密切的相互交流(Cross-talk) 现象，其中线粒体可反向调控细胞核的基因转录，因此线粒体治疗的抗肿瘤机制可能与线粒体-核的互作有关。微阵列分析表明线粒体可调节细胞周期蛋白D1、ras、src和p53等几种致癌途径，参与其抗肿瘤作用。

此外，线粒体是对环境氧和酸碱度极为敏感的细胞器，在不同的环境中发挥促进细胞存活或诱导细胞死亡的两极功能。由于正常生理状态的体细胞以线粒体呼吸作为主要能源，因此补充线粒体可提高其能量供应以改善细胞功能。但在缺氧和酸性环境中的肿瘤细胞，补充外源线粒体则会导致ROS升高、诱导细胞死亡通路。线粒体这种环境响应性的特性将可能使其具有选择性抗肿瘤作用。

2、线粒体治疗在癌症转移中的应用：

改变线粒体功能定义肺癌转移细胞状态，并创造可利用的漏洞

《Metabolism and chemical biology》if:13.312

肺癌是一种流行且致命的癌症类型，转移性癌症扩散是导致大多数癌症相关死亡的原因，为了揭示维持转移生存或生长所特别需要的基因，研究人员在肺腺癌非转移和转移状态的细胞中进行了基因组规模的缓病毒shrna库筛选。线粒体核糖体和线粒体相关基因被确定为与转移特异性致死相关的基因集。从自体肺癌小鼠模型进行的体外转移源细胞系和离体转移分析显示，与非转移原发肿瘤相比，线粒体膜电位较低，线粒体功能也较低。转移灶的电子显微镜显示不规则的线粒体失去正常的膜结构。与这些发现一致的是，抑制线粒体转录或复制的化合物对转移源性细胞的生长有更大的影响。这些结果表明，肺腺癌的转移细胞状态与一种特殊改变的线粒体功能有关，并且可以用于治疗。

2.1 转移特异性致死/致病基因的验证：

 图A，选择验证基因的标准。我们采用了三种方法来发现对Met细胞系具有不同影响的基因，并根据描述的标准选择了240个候选基因。

图B-C, 20倍体外前(早期)和后(晚期)的代表。在两个TnonMet (368T1;B)和Met (238N1;C)细胞中，致死基因表达减少，惰性基因不变，有利基因增加。候选基因在Met细胞中的代表性显著降低。每个点代表一个shRNA。

图D，每个shRNA对Met和TnonMet细胞的差异影响。每个细胞系在早期时间点和晚期时间点之间表现变化的差异显示为Met特异性效应。

图E，根据未归一化的P值绘制对Met细胞的差异效应，揭示了具有最大折叠效应和高重复性的顶级候选基因。每个点代表一个shRNA。这些方框表示在Met细胞中至少增加2倍(蓝色方框)或4倍(红色方框)的候选shrna，这意味着它们对Met的杀伤力至少是TnonMet细胞的2倍或4倍。

图F，评估候选基因对体内癌细胞生长的影响的平行体内筛选概述。

图G，体外和体内对Met细胞的作用基本一致(482N1)。

2.2 线粒体靶向策略的转移特异性效应

图A，二次体外筛选shRNA表达变化的Heatmap，按其对Met细胞的影响程度排序(红色)。热图旁边列出了体外转移特异性作用最高的20个shrna。基因名称后面的数字表示针对该基因的两个shrna中的哪一个被识别，

图B，根据shRNA对Met细胞的影响程度排序的二次体内筛选中shRNA表达变化的Heatmap(红色)。对应的基因/shRNA名称和数据值的数据表见Supplementary data Table S9。热图旁边列出了在体内具有最高转移特异性效应的前20个shrna。基因名称后面的数字表示针对该基因的两个shrna中的哪一个被识别，因为在第二个筛选中每个基因使用两个shrna。

图C，在体外培养过程中，在Met细胞系样品中特异性失去表达的基因的GSEA。上面展示了一个最特异的met致死途径的例子。竖条是按必需性排序的基因集/通路中所代表的基因，富集分数在上面的图表中(绿色的)。中间列出了GSEA分析确定的引起met特异性致死shRNA治疗反应的途径;唯一显著的基因集，表示线粒体核糖体，用粉红色突出显示。底部列出了基因本体(GO)项分析的结果。它确定线粒体和线粒体核糖体作为顶级细胞复合体，以转移特异性致死为目标。

2.3 由于线粒体功能的改变，转移细胞系对线粒体靶向治疗更敏感

图A-D, 50 ng/mL溴化乙锭(A)、15 mg/mL强力霉素(B)、200 mmol/L phenformin (C)、2 mmol/L FCCP (D)处理Met (482N1)和TnonMet (394T4)细胞系的体外竞争试验表明，二者对Met细胞的处理效果更高。数据归一化为未经处理的对照;给出了在三个重复中至少进行三个独立实验的一个代表性实验。

图E-H，海马分析Met和TnonMet细胞系(各3个)来测量耗氧率。根据实验说明，用E中所示化合物处理细胞。Met细胞系的备用呼吸能力较低，并且耦合效率较低)。ECAR/OCR比分析表明，糖酵解在Met细胞中使用更高(H)。

图I-L, Seahorse MitoFuelFlexTest分析Met和TnonMet细胞系(各3个)，以测量燃料容量和依赖性。Met细胞对糖酵解衍生的丙酮酸，它们使用谷氨酰胺的能力较低，表明氧化磷酸化过程中谷氨酰胺作为燃料的比率降低。

图M，在含半乳糖培养基中培养的Met和TnonMet细胞系(各3个)中，用倒置的CellTiter-Glo分析ATP水平。

图N，在含半乳糖培养基和含葡萄糖培养基中培养的Met和TnonMet细胞系(各3个;P 0.1377)。数据以半乳糖/葡萄糖比值计算。

图O，细胞在含葡萄糖和半乳糖培养基中的相对生长分析。数据以δ(葡萄糖半乳糖)计算。

图P，JC1染色Met(n2)、TnonMet(n2)细胞系，流式细胞术测定相对去极化。

图Q，流式细胞术对TnonMet(H)和Met(I)细胞系进行ROS染色，测量相对ROS产生。

3.人类癌症线粒体基因组的全面分子表征

2020年3月发表在Nature genetics（IF：14.307)上的一篇文章Comprehensive molecular characterization of mitochondrial genomes in human cancers，作者使用pan-cancer研究的WGS和RNA-seq数据，对癌症线粒体基因组进行了全面的分子表征。

3.1 研究背景

线粒体作为“细胞的动力源”，在通过氧化磷酸化产生大部分细胞能量的生物过程中起着至关重要的作用。环状的线粒体基因仅有16.6 kb，但仍编码13种蛋白质，与其他核来源的蛋白质形成呼吸链复合体。由于能量代谢的改变是癌症的共同特征，线粒体可能参与癌变过程。此外线粒体也在与肿瘤发生有内在联系的其他生物过程中起重要作用，例如生物合成、信号传导、细胞分化、细胞凋亡、维持对细胞周期和细胞生长的控制等。

目前关于线粒体基因组的研究多为基于小样本队列的单一维度研究，并且大多使用全外显子测序数据，因此尚未获得跨癌症类型的线粒体全面、多维分子景观。此外，过往研究仅集中于线粒体改变的模式，而没有充分探索线粒体基因组和核基因组之间的相互作用以及线粒体改变的生物医学意义。本文使用PCAWG生成的38种癌症的全基因组测序数据，对癌症线粒体基因组进行了全面的表征。

3.2 癌症线粒体基因组的突变景观

图1a,b：多维度整合分析方法概述和mtDNA置换突变的概况

图1c-f：mtDNA的突变特征：置换类型、年龄和核驱动改变背景

3.3 线粒体基因组的超突变过程

图2a,b：mtDNA突变数量分布和超突变样本的突变谱

其中最显著的是乳腺癌样本SP6730，有33个突变，其中30个位于一个2kb的区域，导致局部突变率比背景突变率高75倍。独立的外显子组和RNA-seq分析证实，这些突变有70%是新发现的，并非胚系突变和测序错误造成的突变。其中绝大部分的局部突变（n = 28）为L链的T>C置换，并且互相co-clonal，有高度相似的VAFs（~7%）。

这些特征支持28个局部突变(19个错义，4个沉默和5个tRNA突变）是通过一次“single-hit”的灾难性突变机制获得的，类似造成链特异性T>C置换主导的突变谱的机制。这与核基因组的kataegis现象（在癌症基因组中发现的局部超突变模式）以及一种已报道的mtDNA复杂体细胞突变相似，图2d介绍了可能的机制：mtDNA在一次“single-hit”中获得了这些突变，并且突变拷贝通过细胞系的一系列复制，具有了较明显的VAF（~7%），但导致缺陷表型的概率很低。

3.4 mtDNA突变中癌症类型特异性的选择压力

图2c,d：乳腺癌超突变样本的突变分布及可能的机制

为了研究mtDNA突变对其功能的影响，解释mtDNA的特异性突变特征，作者以一种对错义突变选择压力的常见测量：dN/dS比率（同义/非同义置换比率），进行了初步分析。结果发现不同类型癌症、不同VAFs上错义突变的dN/dS总体上接近1，表明对mtDNA错义突变的总体选择接近中性。

作者进一步分析了不同的突变类型的VAF分布，发现并非所有突变都是乘客突变。13个mtDNA基因的截短突变（导致蛋白质产物截短的突变(即无义突变和移码indels)）在大多数癌症类型中表现为阴性选择，VAFs明显比错义突变或沉默突变的VAFs受到更大程度的抑制，表明完整的线粒体功能在癌细胞中的重要性。

3.5 mtDNA突变中癌症类型特异性的选择压力

图a，肾/结直肠癌/甲状腺癌与其他癌症类型截断突变的VAF积累曲线明显。为了进行比较，在其他类型的癌症中，对突变数进行归一化后，沉默突变和错义突变产生了类似的曲线。。一般来说，在较高的等位基因频率水平(红色)观察到较少的截断突变，除了肾癌、结直肠癌和甲状腺癌类型(蓝色)。

图b，肾嫌色症、肾乳头状癌、结直肠癌和甲状腺癌积累了过多的高等位基因频率截断突变(括号中的样本大小)。VAF间隔为0.6-1.0时不同癌症类型的曲线下面积。

图c, ND5中截断突变的分布模式。

图d，肾嫌色细胞癌和肾乳头状癌肿瘤基因mtDNA截断突变与反复体细胞突变的热图。MT_truncating是线粒体截断突变的标准，包括移码突变和停止增益突变。

图e，在截断突变的癌症样本中，核基因富集的信号通路的热图。

3.6 mtDNA到核基因组的体细胞转移（somatic transfer）

图a-b：不同癌症类型中SMNTs的发生频率以t检验比较有无SMNTs的样本中SMNTs与核基因组结构变异的关系，结果显示与对照组相比，有SMNTs的样本在核基因组中具有更多的总体和局部结构变异（P = 1×10−4，图4b）。图b中有无SMNTs样本中核基因组结构变异的发生频率。

图4c：不同类型结构变异中SMNT断点到最近的结构变异断点的距离

尽管总体上SMNT发生频率较低（约2%），但一些癌症样本显示了超过3个独立的SMNT事件（图4d），并且一些mtDNA片段会大量重排，这表明SMNT事件发生时基因组极不稳定。

图4d展示了一例膀胱癌样本基因组中三个独立SMNT事件的Circos图，灰色曲线表示染色体重排，红色曲线表示SMNT。

图4e：一例HER2+乳腺癌样本中的SMNT事件。

3.7 mtDNA的拷贝数和结构变异

图5a：不同癌症类型的mtDNA拷贝数

进一步使用方差分析或t检验比较来自同一组织器官的不同癌症亚型的mtDNA拷贝数，结果显示有些癌症类型表现出不同的mtDNA拷贝数分布（图5b）

图5b,c：不同癌症类型和截短组样本的mtDNA拷贝数分析

在有配对正常组织的癌症样本中比较mtDNA拷贝数的变化(n = 507)，结果显示在慢性淋巴细胞白血病、肺鳞状细胞癌和胰腺癌,中癌症样本的mtDNA拷贝数增加，但肾透明细胞癌、肝细胞癌和骨髓增殖性肿瘤中减少（图5d）。这种不同的模式可能是由于癌症特有的致癌刺激、代谢活动和线粒体功能失常所致，比如最近一项研究显示肾透明细胞癌中mtDNA拷贝数的显著降低与HIF1α高度激活导致过氧化物酶体增殖激活受体γ共活化剂1α（线粒体生物生成的关键调节子）下调有关，而HIF1α是肾透明细胞癌中最常见和活跃的突变。

为了评估mtDNA拷贝数的潜在生物医学意义，作者研究了与一些关键临床变量的相关性：

结果发现发现在前列腺癌（图5e）、结肠直肠癌和皮肤癌中mtDNA拷贝数和诊断时的年龄之间存在显著正相关。而大多数病例中正常血液的mtDNA拷贝数与年龄呈负相关。

观察了在多种癌症类型中mtDNA拷贝数与肿瘤分期之间的相关性，结果显示慢性淋巴细胞白血病中mtDNA拷贝数的增加与癌症的高分期有关（图5f）。

由于前列腺癌和衰老组织中已知存在线粒体基因组的focal copy的获得和丢失，作者最后还使用WGS数据分析了样本中mtDNA基因组的结构变异。通过以正常mtDNA序列为参考，计算归一化的测序深度，进而寻找癌症mtDNA序列的读取深度变化来鉴定结构变异区域。结果在2658例癌症样本中，3例样本(0.11%)的mtDNA出现了显著的结构变异（图5g）。

3.8 线粒体基因的共表达网络分析

为了研究13个mtDNA基因在癌症中的功能影响，作者使用TCGA的来自13种癌症类型的4,689例肿瘤样本的RNA-seq数据对基因表达水平进行定量。

结果显示基因表达水平与mtDNA拷贝数之间的相关性在不同癌症中不同。

如图6a所示，mtDNA基因在三种肾癌（嫌色细胞癌、乳头状细胞癌和透明细胞癌）中高表达，而在三种鳞状细胞癌（宫颈、肺和头颈部癌）中低表达，这是mtDNA拷贝数在不同癌症类型中的相对丰度不同所导致的，并且与正常组织中的研究一致。

作者进一步构建了包括线粒体基因和核基因的共表达网络，研究mtDNA基因及其相关的核基因和通路，然后测量网络中核基因到一个线粒体基因的边缘强度，基于所有核基因的排名进行GSEA富集分析。

结果显示氧化磷酸化是最显著的富集通路，并且在13种被检测的癌症类型中有8种显著富集(FDR < 0.05)，突出线粒体基因在能量生成中的重要作用（图6b）。

其他癌症发生中起重要作用的通路也在多种癌症中富集，包括与细胞周期相关的通路（MYC靶点、有丝分裂纺锤体、G2/M检查点和E2F靶点）和DNA修复，已有研究认为mtDNA在这些通路中扮演重要角色。

最后作者检测了以mtDNA为中心的共表达网络（图6c）。结果显示mtDNA几乎在所有癌症类型中都强共表达，作者认为是由于mtDNA基因被转录为长的多顺反子前体（long polycistronic precursor transcripts）。此外，多个临床应用的基因与mtDNA基因呈强共表达模式，例如在前列腺癌中，AR、EGFR、DDR2、MAP2K2与mtDNA基因共表达，而TMPRSS2、NF1、PIK3CA、BRCA1和TOP1是mtDNA基因在多种癌症中最邻近的基因。

4.全新的线粒体基因调控机制

2022年6月2日，来自瑞典哥德堡大学 Maria Falkenberg和卡罗琳斯卡医学院B. Martin Hllberg合作在Cell上发表了文章Non-coding 7S RNA inhibits transcription via mitochondrial RNA polymerase dimerization，阐明了一个全新的线粒体基因调控机制：一个mtDNA自身编码的小RNA（不在上述37个基因之中）可以特异性结合到线粒体转录酶（POLRMT）上，诱导其构象变化，从而控制mtDNA的基因表达。这一发现为治疗诸多相关疾病提供了新的思路。

在1974年，两名美国科学家发现人类线粒体基因组中有一个长度仅188个核苷酸的小RNA，并根据其在超速离心中的沉降系数将其定名为7S RNA。近50年过去了，人们对它的功能仍一无所知。在这项新研究中，研究人员证明了7S RNA抑制线粒体基因表达。他们首先合成并纯化了7S RNA，发现它可以抑制体外构建的线粒体转录系统的活性。进一步分析显示它的抑制作用针对POLRMT。随后他们使用低温电子显微镜（Cryo-EM）发现7S RNA诱导POLRMT形成二聚体，而二聚体的POLRMT无法结合到mtDNA上，从而也无法启动线粒体基因表达。

4.1 7sRNA在体外抑制mtDNA转录

(A)人类线粒体基因组的转录。下图:圆形人类线粒体基因组(mtDNA)的简化图，显示了线粒体启动子(LSP和HSP)的位置以及每个启动子的转录方向。上图:放大的非编码区(non-coding region, NCR)，强调LSP的两种典型产物:7S RNA和LS转录本。在LSP的下游有三个保守的序列块。

(B)线性模板上HSP或LSP的体外转录在不同时间点终止(0、2.5、5、10、15、20、40和60分钟)。CSB II区域转录本和径流(RO)转录本被指出。上面给出了包含HSP的重链模板和包含LSP的轻链模板的原理图。

(C)绘制了三种DNA模板随时间变化的转录水平。

(D)使用含有0.400 nM 7S RNA存在的LSP的线性模板进行体外mtDNA转录。

(E)在7S RNA或随机RNA存在下，线性LSP模板上的体外转录相对定量(平均SD, n = 3)。

(F)增加POLRMT (20 120 nM)的浓度可以恢复7S RNA (40 nM)存在下的线性LSP转录。

(G)在7S RNA(0或40 nM)和TEFM(0、20、40、80 nM)的存在下，使用长线性LSP模板(3000 nt)的体外LSP转录。

(H)分离起始期和延长期的转录脉冲追逐实验示意图。转录反应首先在只有32P-UTP(脉冲)的情况下组装90 s。随着添加完整的冷NTPs (chase)，延伸率继续增加。在脉冲期或追逐期的起始点加入7S RNA。

(I) 7S RNA、POLRMT以及7S RNA和POLRMT一起预孵育的分析凝胶过滤，在Superdex 200柱上进行。分别监测POLRMT和7S RNA在280和260 nm处的吸光度(mAU)。

(J)根据参照蛋白的标准曲线计算复合物中POLRMT和7S RNA的分子量，该标准曲线由分子量对洗脱体积的对数(在I中凝胶过滤)构建。

(K)不含蛋白质的7S RNA的RNase I印迹(N/A)， POLRMT (P)， TFB2M (B)，或两者都有(P + B). RNase T1 (T1)和NaOH (OH)处理的7S RNA作为完全消化对照。

(L)人类7S RNA和CSB区域示意图在顶部。使用线性LSP模板在存在0 80 nM的7S RNA片段的体外LSP转录。

4.2 mtEXO复合物降解7sRNA

(A)75个线粒体mtrna相关基因7sRNA siRNA差异火山图。

(B)7sRNA 在siCtrl、siSUV3和siPNPT1 HeLa细胞中的代表性ScanR图像。

(C)垂直散点图显示ScanR检测到的每个细胞7S RNA强度。每个点代表一个单独的单元格。

(D)重组人mtEXO复合物降解7S RNA。左:7S RNA (16 nM)与增加浓度的mtEXO复合物或SUV3孵育。

(E) 7S RNA在sitrl、siSUV3或siPNPT1 HeLa细胞中的Northern blot。每个通道都装载了等量的RNA。

(F)与(D)相同，在HeLa细胞中使用10 3个以上的RNA，不使用siRNA(对照)和混乱对照(siCtrl)处理。

(G) northern blot检测HeLa细胞中siCtrl、siSUV3或siPNPT1线粒体mRNA和rRNA (12S)。装载控制:18S RNA。

(H) Denovo在siCtrl和siSUV3 HeLa细胞中合成mtRNA。

4.3 在SUV3耗尽的细胞中7S RNA与POLRMT相关

(A) 7sRNA FISH和COXIV免疫染色双标记的siCtrl和siSUV3 HeLa细胞的代表性共聚焦显微镜图像。

(B)垂直散点图显示7S RNA颗粒的最大Feret直径。

(C) 7S RNA FISH和POLRMT免疫染色双标记siCtrl和siSUV3 HeLa细胞的代表性结构照明显微镜(SIM)图像。比例尺，10mm。与(A)相比，在siCtrl细胞中强度增强，呈现POLRMT和7S RNA的共定位。放大的区域由白色虚线和标杠表示，1mm。

(D)颗粒状的POLRMT和7S RNA荧光信号的百分比。

(E)图中POLRMT和7S RNA之间的Mander共定位系数，每个点代表一个单个细胞。

(F)稳定RNA (mtRNA)、新合成RNA (BrU)和COXIV免疫染色三标记的siCtrl和siSUV3 HeLa细胞的代表性共聚焦显微镜图像。

(G) Manders新合成的RNA (BrU)与稳定的RNA (mtRNA)在全细胞或颗粒(siSUV3)中的共定位系数。

4.4 SUV3的缺失导致7S RNA和mtDNA颗粒的积累

(A)从头合成了siCtrl和siSUV3 HeLa细胞的mtDNA和7S DNA。

(B) 7S RNA FISH和dsDNA免疫染色共标记的具有代表性的HeLa细胞siCtrl、siSUV3和siPNPT1共聚焦显微镜图像。7S RNA是绿色的;dsDNA用红色表示;DAPI用蓝色表示。

(C)用7S RNA FISH和dsDNA免疫染色共同标记的siCtrl和siSUV3 HeLa细胞的代表性共聚焦和受激发射耗尽(STED)显微镜图像。

(D)共聚焦和STED显微镜图像中siCtrl和siSUV3 HeLa细胞类核直径的相对频率和平均值。

(E)基于共聚焦的7S RNA和dsDNA强度谱和来自(C) siCtrl细胞插入的STED显微镜图像的行扫描分析。

4.5 7sRNA抑制POLRMT向转录起始位点的招募

(A)与线粒体转录起始复合物结合的DNase I足迹模板示意图。TFAM诱导DNA模板上的u型结构，并在启动子处招募POLRMT和TFB2M。

(B) DNase I足迹显示，增加7S RNA的浓度(0.1:1,1:1,3:1 7S RNA:POLRMT)可以抑制POLRMT和TFB2M在TSS的结合(箭头)。蛋白质分别与DNA模板或7S RNA孵育10分钟。TFAM结合位点(绿色)、POLRMT + TFB2M结合位点(黄色/橙色)和TSS的位置/方向显示。

(C) 包含LSP TSS的DNase I裂解产物的密度分布。所示的DNA序列(x轴)是非模板链(5030方向)。

小结：

线粒体基因组编码氧化磷酸化系统的13个组成部分，并改变线粒体转录驱动各种人类病理。在哺乳动物细胞中，一种被称为7S RNA的多聚腺苷化的非编码RNA分子从光链启动子的直接下游区域转录，其水平随着生理条件的变化而迅速变化。在这里，我们报道了7S RNA具有调节功能，因为它控制了体外和培养的人类细胞的线粒体转录水平。利用低温em，我们表明POLRMT二聚是诱导与7S RNA的相互作用。由此产生的POLRMT二聚体界面会隔离启动子识别和解开所必需的结构域，从而阻止转录起始。我们提出，非编码的7S RNA分子是调节哺乳动物细胞线粒体转录的负反馈回路的一个组成部分。

线粒体基因表达是一个动态平衡的过程， 那么去除7S RNA，从而恢复POLRMT功能的机制是什么呢？针对这个问题，该文作者们继续研究并发现RNA降解酶复合体mtEXO可以降解7S RNA，从而形成一个完整的负反馈控制系统：POLRMT以单体形式结合到mtDNA上启动表达，生成7S RNA。7S RNA反过来诱导POLRMT形成二聚体，抑制其活性。而mtEXO可以降解7S RNA，使得POLRMT恢复活性。

“小RNA分子在细胞核内起着很重要的调控作用，我们的这项研究首次发现了一个可以调控线粒体基因表达的小RNA。这一全新的调控机理会为相关疾病的治疗提供新的靶点和思路。” 研究第一作者朱雪峰。研究团队接下来将致力于研究这一调控机理如何在体内感应能量和代谢的变化以及如何在不同疾病中发挥作用。

总结

线粒体障碍在临床上可影响体内的多个系统，尤其是那些需要消耗大量能量的组织或器官。目前的研究结果表明，线粒体治疗的效果显著，且可比一般药物维持更长的时间；此外，自体的线粒体治疗尚未出现明显的不良反应，这些均说明线粒体在一定程度上具有成药性。但线粒体提取纯化的质量控制还有待标准化。向细胞内补充线粒体往往会出现广泛的网络效应，其机制复杂且网点众多，这是由于线粒体本身是一种多功能的细胞器，但最终的表现则是明确的细胞存活或死亡的两极效果。需要说明的是，线粒体治疗的具体分子机制的相关问题仍有待解答，例如，线粒体通透组织屏障的方式、细胞对外源线粒体的相容性等，这些问题的解决将对揭示线粒体治疗的机制至关重要。尽管如此，作为一个新兴的方法，线粒体对疾病的治疗引人注目并值得期待。

文章来源：生信人  转自：医世象 2022-07-20 

作者：dingr