非天然氨基酸FSY标记纳米抗体的应用

以下文章来源于Protein Revolution ，作者nanobodier

今天介绍两篇关于非天然氨基酸FSY标记纳米抗体的工作。

首先介绍的是来自UCSF的Lei Wang实验室的工作，发表在2022年7月14日的Chem杂志（1）。

持续的COVID-19大流行和不断增加的SARS-CoV-2变种需要有效的预防和治疗药物。基于蛋白质的生物制剂具有很高的特异性，但它们的非共价相互作用往往导致药物分离和不完全抑制。

在这里，该工作开发了共价纳米抗体，能够通过proximity-enabled reactive therapeutic (PERx)原理与SARS-CoV-2不可逆结合。设计了一种潜在的生物活性氨基酸FFY，并通过基因编码到纳米抗体中，以加快PERx反应速率。与非共价野生型纳米抗体相比，加入FSY的共价纳米抗体中和了野生型SARS-CoV-2及其Alpha、Delta、Epsilon、Lambda和Omicron变体，效力显著提高。这种FSY激活的共价纳米抗体策略和增强效力的设计可以对开发有效的治疗各种病毒感染有价值。

设计：

纳米抗体(单域抗体)一般具有热稳定性，易于在细菌中产生，体积小(~15 kDa)，可增加抑制域密度进行高效阻断，可人源化，最大限度降低潜在的免疫原性。多个研究小组选择了与Spike蛋白具有高亲和力的纳米抗体，显示出对Vero细胞或表达ace2的HEK-293细胞感染SARS-CoV-2有良好的抑制作用。该工作的策略是将一种潜在的生物反应性非自然氨基酸(Uaa)整合到纳米抗体中，该纳米抗体特异性结合SARS-CoV-2病毒刺突蛋白的受体结合域(RBD)(图1a)。当纳米抗体与Spike RBD结合时，潜在的生物反应性Uaa会被带向Spike RBD的目标残基，这使得Uaa能够与目标残基特异性反应，使纳米抗体与Spike RBD发生不可逆交联。结合的纳米抗体将阻止Spike RBD与人类ACE2受体相互作用，阻断病毒感染。由此产生的共价纳米抗体将作为近端激活反应性疗法(PERx)。传统纳米抗体以非共价方式结合，与Spike RBD动态结合和解离，与之相比，共价纳米抗体将永久结合Spike RBD，并以增强的效力中和病毒。

最初选择使用潜在的生物活性非天然氨基酸 FSY，因为其稳定性以及在生物相容性和细胞条件下通过近端硫氟交换(SuFEx)反应与Tyr、His或Lys反应的能力。根据SARS-CoV-2 Spike RBD与纳米抗体H11-D4、23纳米抗体MR17-K99Y、24或纳米抗体SR4复合物的晶体结构，该工作决定分别在纳米抗体H11-D4的R27、S30、E100、W112、D115或Y116位点、纳米抗体MR17-K99Y的Y99或D101位点和纳米抗体SR4的Y37、H54或S57位点加入FSY。Western blot分析表达这些突变纳米抗体基因和tRNAPyl/FSYRS，证实FSY在存在FSY的情况下成功地嵌入到纳米抗体中。

结合WT和FSY的纳米抗体用亲和层析纯化。SR4(57FSY)的产量为2.4 mg/L，其他FSY突变体产量相近。质谱对完整SR4(57FSY)蛋白的分析证实FSY在57位点高保真地整合到SR4中。

为了测试FSY结合的纳米抗体是否能在体外共价结合Spike RBD，该工作将2.5M WT纳米抗体或其FSY突变体与0.5M Spike RBD在37℃孵育12小时，然后在变性条件下进行Western blot分析。正如预期的那样，所有三个WT纳米抗体都没有与Spike RBD形成共价复合物。在交联效率较低的H11-D4(115FSY)和H11-D4(116FSY)中检测到稳定的共价复合物，MR17-K99Y(101FSY)交联效率为10.5%，SR4(54FSY)交联效率为28.3%，SR4(57FSY)交联效率为41.3%。然后，该工作进一步研究了Spike RBD与SR4(54FSY)或SR4(57FSY)纳米抗体的时间依赖性交联，结果表明SR4(57FSY)效率更高。后续实验采用SR4(57FSY)。

文章又对改造后的SR4(57FYS)纳米抗体进行多方面的功能验证。

可能大家更关心的是如何在纳米抗体中插入FYS非天然氨基酸。该工作继续查询文献，该文章利用了Lei Wang以前的JACS工作（2）。该工作提出一种利用TGA这个密码子的新的trna合成酶对- tRNA （Pyl UGA）/FSYRS。以遗传方式将FSY整合到大肠杆菌和哺乳动物细胞的蛋白质中。

简单的说，将含有特点位点TGA的pBAD表达质粒与新的trna合成酶配对质粒pEVOL-FSYRS共转化大肠杆菌BL21(DE3)中，表达FSY合并蛋白。转化后的大肠杆菌细胞在37°C、220 rpm、OD 0.5的条件下生长，之后加入0.2%的l -阿拉伯糖。FSY掺入时，在生长培养基中加入1mm FSY。在18°C, 220 rpm条件下表达18小时。

第二个工作是2021年北京大学的陈鹏教授也有基于非天然氨基酸设计及共价偶联纳米抗体的GlueTAC工作发表在JACS杂志（3）。在陈鹏教授的工作中讲PD-L1纳米抗体的L108突变成FSY后，该纳米抗体就可以与PD-L1形成共价结合的复合物。

未来非氨基酸标记纳米抗体及其他蛋白在蛋白药物中会发挥越来越重要的作用。

文献出处：

• 1.  https://doi.org/10.1016/j.chempr.2022.07.012

• 2.  http://pubs.acs.org on March 30, 2018

• 3.  https://doi.org/10.1021/jacs.1c08521

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