梳理共价抑制剂的“共价弹头”

摘要

21世纪初，共价抑制剂在药物发现领域的应用引起了人们的极大关注。目前市场上有50多种共价药物，目前许多共价候选药物在开发中。本综述目的是根据共价抑制剂与非共价抑制剂的作用机制不同，描述共价抑制剂的内在特征、可能性和局限性，从而加深对共价抑制剂发展的理解。我们还介绍了可应用于潜在共价抑制剂开发的最新共价弹头。

1、从偶然发现到理性设计与开发

对20世纪中期到21世纪初批准的药物的调查显示，很少有药物是通过故意引入表面上的共价部分 (如Michael受体) 来开发的。在大多数情况下，在发育阶段引入共价部分并不是经过深思熟虑的，而是通过新陈代谢将部分共价结合到靶标上。相比之下，自本世纪初以来，大多数共价药物的开发都包括有意引入可与靶标相互作用的共价键合部分。其中，丙烯酰胺部分是最常用的。与非共价药物相比，大多数共价药物具有药理优势，如：作用时间更长、药效更强。

虽然共价药物的使用由来已久，但目前的模式正在从偶然发现的时代转向理性设计和开发阶段。最近，包括蛋白质组学在内的药物发现基础科学和技术的进步促进了这一转变，蛋白质组学能够通过确定其结合位点来提高共价药物靶标的选择性。由于药物化学和化学生物学领域对共价小分子的需求不断增加，共价药物的优势及其临床有效性，共价药物的合理设计方法的价值有望增加。

2、共价抑制剂的作用机理和特性

2.1 机制评价

与非共价抑制剂不同，共价抑制剂通过两个步骤抑制其目标蛋白。共价抑制剂作用的一般机制如图1所示。首先，共价抑制剂通过在蛋白质和化合物之间形成特定的非共价相互作用与其靶蛋白结合，类似于非共价抑制剂的结合机制。这一步是由抑制常数(Ki)表示的平衡过程，该常数表示配体的结合亲和力。在第二步中，共价抑制剂的亲电弹头被适当定向和定位在目标蛋白的亲核残基附近。这一步是用于对共价抑制剂进行分类的非平衡过程。如果抑制剂-蛋白质复合物解离的反向反应的速率常数(k−2)等于或接近于零，则该抑制剂称为的不可逆共价抑制剂(图1A)（以青霉素为例）。在这种极端情况下，如果化合物与目标蛋白相互作用足够长的时间，就会观察到近乎完美的抑制作用。相反，可逆的共价抑制剂（以蛋白酶体抑制剂硼替佐为例）与k−2值有关，显示出非共价抑制剂和不可逆共价抑制剂之间的中间状态(图1B)。

图1：(A)不可逆共价抑制剂和(B)可逆共价抑制剂作用的一般机理。

被共价抑制剂结合的靶蛋白可能会失去其原有功能，并表现出所需的抑制活性。对于可逆的共价抑制剂，应进行逆向反应以恢复目标蛋白的原有功能。否则，蛋白质的从头合成应该发生在共价抑制剂被清除之后。在这种情况下，共价抑制与靶蛋白的再合成速率直接相关。从机理来看，共价抑制剂的停留时间应该长于目标蛋白的周转率，才能表现出显著的共价抑制作用。

通常，抑制效力是通过测量Ki或IC50来确定的，这也适用于共价抑制剂。然而，这些方法不适合测量共价抑制剂的效力，因为在这些抑制剂的情况下，Ki和IC50值是时间相关的。要对共价抑制剂的效力进行分级，应考虑第二步的动力学。K2/Ki是不可逆共价抑制剂的准确度量，而K* i(=Ki/(1 +k2/k-2))是可逆共价抑制剂的准确度量。

2.2. PK/PD

在新陈代谢和从体内清除的过程中，药物根据其结合动力学和亲和力到达并结合它们的靶点，从而产生期望的PD反应，以达到药物的治疗效果。通常情况下，非共价抑制剂与其靶点结合并形成快速平衡，使PK成为PD的重要影响因素。具体地说，AUC的增加和清除率的降低将使药物浓度达到显示治疗效果的阈值。为了获得良好的PD曲线，非共价抑制剂的PK参数和结合特性应该一起优化。

相反，基于共价键形成的非平衡步骤，共价抑制剂表现出明显的特征。这一特征也影响了共价抑制剂的PK/PD谱，并且共价抑制剂表现出独特的PK/PD谱。有了这个非平衡过程，共价抑制剂在未反应的化合物被代谢并从体内清除的同时保持其效力。与具有相同PK参数的非共价抑制剂相比，这一特征提高了共价抑制剂的实际疗效(图2)。

图2具有相同PK参数的非共价和共价抑制剂的假想药代动力学(PK)/药效学(PD)曲线。

共价抑制剂的PD与PK相关度较低，且表现出更长的作用时间。例如，奥美拉唑的半衰期很短，约为1h，但其有效性可持续超过12h。因此，研究人员不必考虑通过优化过程来改善PK参数。由于作用时间较长，共价抑制剂通常表现出良好的效力。此外，共价抑制剂通过以较低的剂量和频率使用，从而减少脱靶和毒性。

近年来，不断有共价抑制剂的PK/PD预测模型被开发出来，其优点是能够直接和准确地量化TO。TO代表药物占据给定靶点的程度，可以预测共价抑制剂的最佳用量，从而提高药物开发的成功率。

2.3局限性和选择性问题

使用共价抑制剂可以克服编码目标蛋白的基因的耐药性突变。表皮生长因子受体(EGFR)蛋白已经证明了这一点。如果EGFR(T790M和/或L858R)的结合位点发生突变，非共价抑制剂(如吉非替尼)就会失去活性，而共价抑制剂(如奥西美替尼)仍然有效，并通过与Cys797形成共价键来抑制细胞增殖。然而，发生在目标氨基酸残基上的突变对共价抑制剂是致命的。对于EGFR，C797S突变对奥希替尼的影响。

理想情况下，共价抑制剂只与它们想要的目标蛋白结合，形成药物-蛋白质复合物。然而，共价抑制剂的亲电弹头可以与其他蛋白质上的亲核残基反应，特别是在同一家族或细胞代谢物中。例如，以蛋白质上的半胱氨酸残基为靶点的共价抑制剂可以与谷胱甘肽(GSH)结合，从而扰乱细胞的氧化还原环境。这种非靶点效应与肝脏蛋白结合和药物-蛋白质络合引起的免疫原性引起的肝毒性有关，导致特殊的毒性或半衰化。与不可逆的共价抑制剂相比，可逆的共价抑制剂理论上毒性较小。

因此，共价抑制剂的选择性一直被认为是一个重要的问题。共价抑制剂的作用分两步进行，第一步的选择性由Ki决定。通过优化可以提高化合物对目标蛋白的亲和力。第二步的选择性由蛋白质的靶残基和共价抑制剂的弹头共同决定。在确定目标残留物时，了解目标残留物是催化的还是非催化的是至关重要的。如果共价抑制剂针对的是催化残基，如半胱氨酸或丝氨酸，它就不能区分同一家族中的蛋白质。因此，以保守程度较低的非催化氨基酸为靶标是提高同一靶蛋白家族选择性的一种有吸引力的策略。在选择了合适的靶残基之后，应该为靶残基选择合适的弹头，以最大限度地减少对脱靶问题的担忧。通常情况下，弹头的反应性取决于其电子特性和空间因素。根据每种弹头的特点，在药物研制过程中对反应性和选择性进行微调是可行的。

3. 用于共价抑制剂的有希望的弹头

在这部分中，综述了最近开发的α，β-不饱和羰基和最近报道的有希望的亲电弹头，如硫(VI)基团、杂芳族基团、应变释放基团和末端炔基，这些基序可以产生可逆或不可逆的抑制作用。关于共价弹头的更多详细案例，另见J. Med. Chem. 2019, 62, 5673−5724.

《New Electrophiles and Strategies for Mechanism-Based and Targeted Covalent Inhibitor Design》

3.1 α,β-不饱和羰基

在以半胱氨酸为靶标的共价抑制剂中，最常用的亲电子结构单元是迈克尔受体，如丙烯酰胺和其他α,β不饱和羰基化合物(图3A)。丙烯酰胺弹头的烯烃部分通过Michael加成与半胱氨酸中的硫醇基团发生不可逆反应，形成共轭加合物(图3B)。Neratinib (2017年)、dacomitinib (2018年)和zanubrutinib (2019年)是FDA最近批准的含有丙烯酰胺的药物的著名例子，该药物可与半胱氨酸发生不可逆的共价反应，并能够抑制人类蛋白激酶(图3C)。

图3 α,β-不饱和羰基部分丙烯酰胺作为半胱氨酸靶向共价弹头。

为了避免丙烯酰胺共价抑制剂的脱靶效应，已有大量的案例报道，丙烯酰胺已被其他反应性基团取代，以改善反应性和安全性。在α-位引入一个强吸电子氰基被证明在抑制剂和目标蛋白的半胱氨酸之间诱导了一个紧密的可逆的共价键(图4A)。氰基增加α-位的酸性有利于硫醇加成和硫醇加合物的消除(图4B)。Taunton等人通过对α-氰基丙烯酰胺弹头进行系统的结构改造，进一步开发出含有末端封端的α-氰基丙烯酰胺的BTK抑制剂，表现出较长的靶停留时间(图4C和图4d)。

图4 α,β-不饱和羰基部分氰基丙烯酰胺作为半胱氨酸靶向共价弹头。

烯丙酰胺基团表现出较弱的缺电子特性，为取代丙烯酰胺基团的反应性生物同功酶(图5a和b)。2018年，赵等人提出了一种合成和优化联烯酰胺共价抑制剂的方法，该方案能有效地抑制T790M/L858R双突变体和野生型EGFR激酶的酶活性(图5C)。然而，含烯丙酰胺的化合物在血浆和体内表现出较差的药代动力学性质和较低的稳定性。

图5 α,β-不饱和羰基部分联烯酰胺作为半胱氨酸靶向共价弹头

3.2 硫(VI)弹头

近年来，反向药物发现(IDD)被发现是开发共价抑制剂的一种很有前途的策略。2016年和2018年，凯利等人。将未被开发的卤化硫(VI)芳基氟硫酸盐应用于IDD策略(图6A)。与磺酰氟化物相比，芳基氟硫酸盐在硫(VI)氟化物交换(SuFEx)反应中表现出更高的动力学稳定性、更好的选择性和最小的脱靶效应。芳基氟硫酸盐与靶蛋白结合的潜伏期在很大程度上受弹头的可逆结合、残基的适当取向和反应的过渡态稳定性的影响。此外，X射线晶体结构数据显示，这些芳基氟硫酸盐与赖氨酸和酪氨酸侧链发生化学选择性反应(图6B)。

图6 IDD方法中使用的硫磺(VI)弹头。 

3.3 杂芳族弹头

杂芳砜和亚砜是一种新出现的硫醇反应性亲电试剂，这些杂芳族亲电体通过亲核芳香取代反应或亲核加成反应与半胱氨酸残基的硫醇反应。2020年， Bollong等人鉴定了一系列2-磺酰基吡啶为硫醇反应性亲电基团，允许基于亲核芳香取代的半胱氨酸修饰(图7A和图7b)。该系列的亲电性通过在C3位引入吸电子基团对2-磺酰基吡啶支架进行化学结构优化来调节。通过发现腺苷脱氨酶(ADA)的选择性共价修饰物，他们证明了2-磺酰吡啶反应基团作为共价抑制剂的潜力(图7C)。

图7杂芳砜被报道为硫醇反应性亲电体

McAulay等人鉴定了炔基苯并恶嗪和二氢喹唑类化合物为能够捕获半胱氨酸的新的活性和选择性杂环部分(图8a和8b)。通过引入苯并恶嗪基序，Michael受体与芳香环的共轭得到了扩展。他们展示了这些新的部分在Janus激酶3(JAK3)激酶药物支架中的应用，以及它们相对于丙烯酰胺类抑制剂的体外PK谱的改进(图8C)。

图8炔基苯并恶嗪和二氢喹唑啉被报道为半胱氨酸靶标弹头。

3.4 应变释放模式

在菌株释放的基团中，双环[1.1.0]丁烷(BCB)衍生物被探索为潜在的应变亲电体(图9A)。BCB是一个高度应变的环，它会经历亲核开环。使用BCB酰胺作为一种新型的应变亲电弹头。菌株驱动的BCB酰胺亲核加成使活细胞中的半胱氨酸残基能够选择性共价靶向(图9B)。与半胱氨酸硫醇的共价键的形成和硫醇与BCB的反应性的调节都是通过附加吸电子基团来控制的。此外，BCB酰胺被应用于BTK抑制剂，在人类细胞中对BTK表现出比基于丙烯酰胺的探针更高的选择性(图9C)。

图9报道的BCB酰胺菌株释放基序是半胱氨酸靶向共价抑制剂的弹头。

氮杂环丙啶是最显著的应变亲电体之一(图10A)。该部分已被作为糖苷酶和半胱氨酸蛋白酶的机理抑制剂进行了研究和应用(图10B)。最近，氮杂环丙啶显示出作为其他类靶蛋白的弹头的潜力。2020年，Ciericki 等人开发了NSD1组蛋白甲基转移酶的第一类不可逆共价抑制剂(图10C)。在本研究中，他们揭示了NSD1的自身抑制环的构象在与共价抑制剂结合时发生了改变，晶体结构分析证实了这一点。由此，共价弹头被引入到埋藏在疏水部位的自抑制环的靶向Cys2062中。在评估的弹头中，氮丙啶部分可以成功地标记Cys2062，这是使用丙烯酰胺部分无法做到的。由于其相对较小的尺寸和疏水特性，氮杂环丙啶适合于靶向埋藏的结合位点。

图10菌株释放基序氮杂环丙啶被报道为半胱氨酸靶向共价抑制剂的弹头。

3.5 末端炔烃

末端炔烃通常用作生物正交的点击手柄，但它们最近被归类为半胱氨酸靶向共价抑制剂的弹头(图11A)。2013年，Ovaa等人表明了泛素的C-末端炔丙基部分与脱泛素化酶(DUBS)的催化半胱氨酸残基以活性为基础的方式反应，通过原位的硫醇-炔基加成形成不可逆硫醚键(图11B)。此外，在2019年，炔基被引入组织蛋白酶K(CatK)的小分子共价抑制剂(CatK)中作为潜伏电泳体(图11C)。炔基的内部碳与半胱氨酸之间的反应形成马尔可夫尼科夫式产物。在人破骨细胞中也观察到CatK介导的骨吸收受到抑制。

图11报告为半胱氨酸靶标弹头的末端炔烃部分。 

4.结论

相比于非共价药物，共价药物显示出理想的优势，它可以抑制蛋白质靶标的重新激活，直到蛋白质再生，而非共价药物在解离之前只短暂地结合目标蛋白质。随着共价抑制剂的发展，传统的不可成药的靶蛋白也被重新应用。选择性地结合氨基酸（如赖氨酸、酪氨酸、天冬氨酸和半胱氨酸）反应性基团的发展是未来研究的一个有趣的课题。合理开发共价抑制剂是未来重要的研究领域。

参考文献：

Kim H ,  Hwang Y S ,  Kim M , et al. Recent advances in the development of covalent inhibitors[J]. RSC Medicinal Chemistry, 2021, 12(7):1037-1045.