张时民 | 显微镜数字化成像技术在临床检验医学中的应用 | 专家论坛 （一）

FOCUS ON IVD CHINA  

◤数字化概念与相关指标

进入21世纪后，随着机器视觉算法与成像芯片的快速发展，数字成像与处理技术几乎以摩尔定律在进化。相机的成像速度取决于两个方面：（1）数据传输速度；（2）相机成像芯片刷新速度。

表1列举了常见的相机接口，最快的为100G光纤传输，每秒可传输100亿个像素。在显微镜数字化成像时，还可以通过半反半透镜拆分明场成像（多人阅片显微镜），使用多个相机同时拍摄，进一步提高数字化速度。

◤  组织病理学全片数字化的发展与应用   

当数码相机能对任意显微镜视野进行拍照后，把整张样本玻片拍摄下来形成一个数字化玻片就成了下一个趋势。Wetzel和Gilbertson在1999年  ［1-3］  第一次将whole-slide imaging  (WSI，全片扫描，全景图像，全片数字化，全片成像)  应用在病理诊断工作中。 

显微扫描仪是一台自动化的显微镜，它能够完成自动聚焦，X/Y载物台能按物镜的成像面积移动样本，数码相机逐个视野拍摄后，软件将每个视野图像按顺序排列，形成一个数字化玻片  （虚拟玻片）  。  病理科是医疗领域中显微镜使用的主要科室，通常使用20X物镜  （部分场景40X物镜）  观察组织切片标本及其他染色样本，因此成为显微扫描仪的首批使用者。 

数字化的显微图像有着显著的使用便捷性与智能分析优势：   

01   可复制性，相比物理玻片，数字化玻片的存储与分享极为便利  （远程会诊，教学）  。 

02   计算机辅助诊断  （机器视觉、深度学习AI分析）  将极大地缓解病理医生的工作强度，提供更稳定的检测结果，如免疫组化的Ki67、Her-2染色阳性的定量计算。 

03   基于深度学习的肿瘤组织区域的自动识别及分类，该领域经过多年的发展已经取得了诸多的成果，例如  通过提取H&E染色的前列腺癌组织细胞的细胞核特征，对前列腺癌阳性样本的检测率可达到96.7%  ［4］  。  对肿瘤Gleason分级准确性为：95.8%区分3至4级，96%区分3级与初期  ［5］  。再例如  乳腺癌的预后判断，通过对肿瘤组织的组织微阵列H&E染色样本进行全面训练，可独立预测病人的5年生存期  ［6］  。 

数字化病理在美欧病理实验室中已经普及，美国FDA也批准了数字化病理扫描仪用于肿瘤首诊报告中。大型学术机构研究显示  ［7］  ，使用0.25μm/像素分辨率扫描各种组织样本，由擅长骨髓、软组织系统，生殖系统，消化系统，乳腺系统，妇科系统和皮肤系统的8位病理医生比较了数字化阅片与光学显微镜下阅片的差异。一共204个样本，2091张玻片，每张玻片的中位文件大小为1.54 GB，中位扫描时间为6分24秒，中位扫描区域是32.1 × 18.52 mm。与光镜下阅片的结论一致性为99.3%，但数字化阅片效率降低了19%。阅片效率的下降主要是由于计算机对图像的刷新响应延时、病理专家对软件的使用不熟练以及数字化图像与光镜下的呈现差异造成的。当使用计算机辅助诊断工具时，诊断效率将会大幅提升。 

虽然组织病理通常只使用20×或40×物镜成像，但扫描仪在实际使用中仍会遇到聚焦问题，如封片时有气泡，组织有折叠，这些都会使机器在扫描时无法确定准确的成像聚焦位置。绝大部分情况下，扫描仪可以提供与光镜下一致的成像质量。在0.25μm/像素分辨下时，全片20×40 mm区域一共包含128亿个像素，理论上使用当前最快的相机  （24亿像素/秒）  ，全片数字化仅需5~6秒便可完成，但实际情况要复杂得多。影响因素主要包括： 

01   物镜的视场大小：  当前显微镜的物镜视场大小  （镜头上端的直径）  通常为22 mm或26.5 mm  （高级别物镜）  。由于芯片是呈矩形的，为避免超出镜头有效成像圆形区，芯片需内接矩形于视场范围内，这就限制了可用成像芯片的大小，通常不超过一英寸。 

图1   不同数码相机的成像芯片尺寸 

02   芯片的像元尺寸：  从最小1μm至12μm，像元越大成像质量越好  （信噪比高）  ，但同样面积下的像素数量少，相机采样分辨率低。为获得0.25μm/像素的成像分辨率，可以使用表2中的组合： 

03   镜头的光学分辨率  ，即NA值  （数值孔径）  ：如果镜头本身的光学分辨不够，采样分辨再高也无法得到满意的图像质量。如用1μm像元的芯片配合10x物镜时，便可获得0.1μm/像素的采样分辨率，但此镜头的光学分辨率只有1.1μm  （表3）  ，最终的数字图像的光学分辨率也只有1.1μm。一般采样分辨率需≤1/2光学分辨率，明场下极限光学分辨率为0.2μm，0.1μm/像素的采样分辨率是保真光学分辨的最低分辨率。 

综上所述，显微图像的最终质量取决于：  （1）镜头的光学分辨率，这是基础。  （2）采样分辨率，尽可能地保真光学分辨率，但由于芯片自身的信号处理问题，数字化的光学分辨率永远是损失的。 

在数字化病理实践中，通常扫描采用NA0.75的镜头  （可以是20X或40X物镜，光学分辨为0.37μm）  ，对应于传统显微镜的20X物镜时，采样分辨为0.5μm/像素；对应于40X物镜时，采样分辨为0.25μm/像素。为了使扫描效率更高，通常会使用放大倍率低的物镜，因为它的成像范围更大，景深更大，适用于更大尺寸的成像芯片。 

显微扫描仪在工作过程中会遇到与手工操作显微镜相同的聚焦问题。表4列举了不同NA值的镜头的景深，即焦点前后仍维持成像清晰的距离范围。可见放大倍率越低的镜头，聚焦越容易，因为景深大，不容易出现失焦。当使用20X镜头NA 0.75时，镜头的景深能维持在2μm左右，这个景深恰好提供了高速成像的前提条件。      

图2 镜头景深计算公式

显微扫描仪的轨道加工精度也至关重要，在制造成本可接受的情况下，高精度直线运动轨道在100 mm距离内可维持在10μm以内的变化，短距离内的差值可以维持在1μm以内。如果镜头的景深有2μm距离时，扫描50 mm直线时，仅需4~5聚焦点高度便可使整个扫描路途都在景深范围内；另外组织样本本身有3~6μm的厚度，这个样本厚度范围内都可阅；这些因素的叠加使得在20×镜头时可在几分钟内完成全片扫描  （WSI）  。扫描时间由两部分构成：聚焦点聚焦时间和扫描时间。通常15×15 mm组织区域设置3×3或5×5个聚焦点，使用双线性差值法或最小三角形差值法计算剩余区域的焦距高度。扫描质量与聚焦点的数量呈正相关，聚焦点越多，扫描质量越好，但耗时越长。主流的做法将扫描分为低精度  （聚焦点少）  与高精度  （聚焦点多）  ，或在一定聚焦点数量下扫描后对图像作检查，如果质量不满意，再增加聚焦点数量。 

病理样本处理时间长，批次集中，相应扫描仪的玻片仓容量也较大，从8片到1000片不等，玻片放置到仪器上后可24小时内不间断扫描。数字化病理经过了近二十年的发展，已经趋向成熟，能够满足绝大部分日常的组织H&E染色样本，如果有例外情况出现，需要更高倍镜观察，病理专家可以回到显微镜下进行手工镜检。虽然数字化阅片在病理学中具有广泛应用，但在细胞病理和血液病理领域，数字化阅片的发展是停滞的，原因在于这两个领域的样本需要更高倍率、更高分辨率的扫描，有的还需要多层扫描。过长的样本数字化时间  （效率低下）  使得数字化本身不具有临床实际使用的意义  ［8］  。   

图3   宫颈液基片人工阅片时间 

图4   宫颈液基片扫描时间与文件大小，可见如果使用40X倍镜扫描7层，将耗时95分钟

【参考文献】

[1]Digital Imaging in Pathology: Whole-Slide Imaging and Beyond，Annu[J]. Rev Pathol. Mech Dis,2013,8:331-359.DOI:10.2147/PLMI.S59826.

[2]Ho J, Parwani AV, Jukic DM, Yagi Y, Anthony L, Gilbertson JR. 2006. Use of whole slide imaging in surgical pathology quality assurance: design and pilot validation studies[J]. Hum Pathol,2006 ,37(3):322-331. DOI: 10.1016/j.humpath.2005.11.005.

[3]A Comprehensive Review of Computer-aided Whole-slide Image Analysis: from Datasets to Feature Extraction, Segmentation, Classification and Detection Approaches Artificial Intelligence Review (2022). DOI:10.48550/arXiv.2102.10553.

[4]Multifeature prostate cancer diagnosis and Gleason grading of histological images[J]. IEEE Trans. Med. Imaging 26:1366-1378.

DOI: 10.1109/TMI.2007.898536.

[5]Integrated diagnostics: a conceptual framework with examples[J]. Clin Chem Lab Med,48:989–98. DOI: 10.1515/CCLM.2010.193

[6]Whole slide imaging equivalency and efficiency study: experience at a large academic center Matthew G. Hanna[J]. Modern Pathology , 2019, 32:916-928. DOI:10.1038/s41379-019-0205-0.

[7]Potential quality pitfalls of digitalized whole slide image of breast pathology in routine practice[J].Modern Pathology.DOI:10.1038/

s41379-021-01000-8.

[8]Digital Slide Imaging in Cervicovaginal Cytology A Pilot Stud，Arch Pathol Lab Med—Vol 137, 2013 .DOI: 10.5858/arpa.2012-0430-OA.

-End-   题图 | 摄图网  

编辑 | 骆秉涵 王迪

原文以《显微镜数字化成像技术在临床检验医学中的应用》为题发表在《临床实验室》杂志2022年6月刊专题“血液系统疾病实验室诊断”专家论坛版块