纳米抗体：从结构解析、纳米抗体药物进展到双特异性纳米抗体应用

前 言  

来自于驼类和鲨鱼的纳米抗体（重链可变区VHH），分子量约为传统抗体的十分之一，且具有易表达、筛选、改造和稳定性等优势，被广泛应用于结构生物学，以及肿瘤等疾病的诊断和治疗中。本期小编与各位分享纳米抗体在结构生物学和抗体药物中的应用优势和策略。

1、纳米抗体在解析特定构象蛋白质信息中的应用

结构信息对于更好地了解蛋白质的生物学功能和开发针对这些蛋白质的治疗药物至关重要。 然而，许多蛋白质的结构并不是稳定的，为适应生理功能的需要，它们一直在不同构象之间相互转换，这就给确定其结构时带来了极大挑战挑战。随着纳米抗体的发展，研究者发现纳米抗体可以很好的解决这一问题。纳米抗体的形状扁长且十分紧凑，暴露出的凸形互补位可以进入传统抗体难以接近的蛋白质表面空腔或裂缝中。并且，蛋白质的表面空洞或裂缝通常可以很容易地被纳米抗体的CDR3区特异性识别。这也使得纳米抗体能够成为将构象动态蛋白质稳定到特定构象中的有前途的工具。 Rasmusse等人用激动剂结合的β2肾上腺素能受体(β2AR)免疫骆驼[1]。然后，建立了一个纳米抗体库，并筛选出了针对激动剂结合的β2AR的纳米抗体，并确定了一种纳米抗体可以在结晶过程中稳定活性β2AR结构。这项工作代表了该领域的开创性研究之一。自此，纳米抗体被广泛应用到用于到 GPCR 领域，以选择性地将受体固定到特定的构象中。NB9-8用于稳定M2毒碱受体(M2R)与正构体激动剂的结合；Nb39 分别用于稳定激动剂结合的μ-阿片受体 (μOR) 和 κ-阿片受体 (κOR)。 McMahon 等人采用设计的合成纳米抗体库开发了一个用于纳米抗体发现的酵母展示平台 ，该平台主要利用FACS 和 MACS 技术来筛选目标蛋白的构象选择性纳米抗体。通过使用激动剂或拮抗剂稳定目标蛋白的选定构象，然后通过正向或负向筛选特异结合特定构象的靶蛋白的纳米抗体。 例如，在鉴定与 F 类 GPCR 成员 Smoothened (SMO) 的活性状态结合的纳米抗体时，纯化的 SMO 用激动剂 (SAG21k) 稳定。 在阳性选择中，使用 SMO/SAG21k 复合物选择纳米抗体。 在阴性选择中，纳米抗体被 Alexa647 荧光基团、M1 抗体或拮抗剂结合的 SMO 耗尽。 经过几轮选择后，确定了一种对激动剂结合的 SMO 具有强结合偏好的纳米抗体。类似的策略已被用于开发其他重要靶标的构象选择性纳米抗体。

图1 酵母展示系统筛选特异性结合SMO/SAG21k 复合物的纳米抗体

2、纳米抗体在注射式药物中的应用

2018年9月，全球首款纳米抗体药物Cablivi（caplacizumab）获得欧盟EMA批准，用于获得性血栓性血小板减少性紫癜（aTTP）成人患者的治疗。caplacizumab是一种强效选择性双价抗血管性血友病因子（vWF）纳米抗体。Caplacizumab靶向血管性血友病因子（vWF）的A1结构域，抑制vWF与血小板之间的相互作用，从而减少vWF介导的血小板粘附和血小板消耗。随着Caplacizumab的成功上市促进了更多纳米抗体药物在临床研究中的开发和评估，涵盖了各种人类疾病的治疗，包括自身免疫性疾病、癌症、心血管疾病和骨科疾病(表1)。

2021年11月，康宁杰瑞恩沃利单抗（KN035，商品名：恩维达）正式被国家药品监督管理局（NMPA）获批上市，成为全球首个皮下注射PD-L1抑制剂。KN035是一种Fc融合的抗PD-L1纳米抗体，用于治疗既往标准治疗失败的微卫星不稳定(MSI-H)晚期结直肠癌、胃癌/错配修复功能缺陷(dMMR)的其他晚期实体瘤。美东时间2022年2月28日，传奇生物和Janssen合作的CAR-T疗法-西达基奥仑赛(cilta-cel)获得批准，也成为首款获得FDA批准的国产CAR-T细胞疗法，用于治疗复发性/难治性多发性骨髓瘤。另外纳米抗体-药物结合物（NDCs）的也是一个非常有前景的领域，肾脏对纳米抗体的快速清除可能是NDC发展的主要阻力。

另外，抗体药物开发中最大的挑战之一是将这些抗体穿过血脑屏障(BBB)用于治疗脑部疾病，然而纳米抗体可以凭借其较小的分子量、较高的组织穿透能力和缺乏Fc片段等优势，在抗中枢神经系统(CNS)疾病的治疗发展中具有特殊的优势。在开发具有跨越BBB能力的纳米抗体方面采用了不同的策略。首先是吸附介导的跨细胞作用，但这种吸附介导的跨细胞作用缺乏组织特异性，可能会导致纳米抗体在其他器官的摄取和堆积。其次是受体介导的细胞穿透，这是该领域一直积极追求的。由于外源性受体蛋白和内源性受体蛋白之间的竞争，内源性受体蛋白可能会降低纳米抗体-受体嵌合体的转移效率。为了克服这一问题，人们开发了以一个亚基为载体的双功能纳米抗体，载体纳米抗体能与受体的非配体结合部位结合，避免与内源性配体的竞争。

3、纳米抗体在非注射式药物中的应用

局部肺部给药可能为肺部疾病的治疗提供优势，直接将药物递送至肺部具有较少全身暴露、快速起效、低剂量和非注射给药的潜力。然而，传统抗体的吸入递送具有挑战性，并且需要具有制备和递送所需的有利物理化学性质的抗体。然而，纳米抗体具有高的溶解性、稳定性、亲和力和组织渗透性，表现出适合吸入给药的各种特性。

ALX-0171 是由3 个靶向呼吸道合胞体病毒（RSV） 融合蛋白的单价单域抗体以甘氨酸-丝氨酸连接而成的三价抗体。Ablynx 公司利用纳米抗体优异的理化性能把ALX-0171 开发成了吸入剂型，可直达RSV 感染的气管及肺部。吸入式药物对当前新冠肺炎的治疗具有极大的潜在价值。从噬菌体展示文库中分离到的NB11-59对SARS-CoV-2具有较强的体外中和活性，其半数中和剂量(ND50)为0.55µgmL-1。由巴斯德毕赤酵母生产的NB11-59，效价为20g L−1，纯度为99.36%，具有良好的稳定性，可被雾化系统雾化[3]。尤其是该纳米抗体在雾化前后保持极高的稳定性，显示出作为吸入性生物治疗药物的前景。

口服给药是另一种非注射给药策略，特别适用于治疗口腔疾病、肠道疾病、肠道病原体。然而，传统抗体不能耐受粘膜组织中的蛋白酶的消化，并被破坏其结构完整性与结合活性。纳米抗体高稳定性的特点可以很好的解决这一问题，另外为了进一步提高纳米抗体的稳定性，可以在所选纳米抗体的FR2和FR3之间引入一对二硫键，以便抵抗胃酸、胃酶和胰凝乳蛋白酶的消化。其次，纳米抗体的生产成本较低，也使得成为口服疗法的可能性。VHsquare公司的V565是一种口服抗TNF骆驼科动物结构域抗体，能抵抗存在于结肠中的蛋白酶，口服抗TNF也可以避免全身免疫抑制。这为局部治疗炎症性肠病提供了一个范例。作为一个新的概念，口腔纳米抗体仍在开发中。口服制剂的口感、对人群的适应程度、口服给药中的禁食等问题还有待进一步探讨。

4、纳米抗体在双特异性抗体中应用

双特异性抗体可以识别和结合两种不同的抗原或表位，连接不同的靶点或功能分子可以减少靶点外效应，降低需要的治疗剂量。尽管有100多种双特异性抗体处于临床前开发或临床试验阶段，但只有三种双抗获得FDA批准：Catumaxomab、Blinatumomab和Emicizumab。 与传统抗体相比，纳米抗体只含有一个重链可变区，避免了四聚体制备双抗过程中重链与轻链的错配，从而实现了双功能纳米抗体的通用性设计。在双抗的设计中，功能纳米抗体部分的组合是多种多样的，并且已经开发了许多策略。首先，针对同一抗原的不同表位的VHH可以组装成双特异性抗体，以提高抗原结合的特异性和减少脱靶效应。这种设计已被应用于对抗细菌和病毒感染以及避免肿瘤免疫逃逸（图2A）。其次，双特异性抗体可以与针对不同抗原的纳米抗体组装在一起，以获得所需的协同效果(图2B)。第三，在双抗的两个亚单位之间插入第三个针对人血清白蛋白(HSA)的VHH可以有效地延长三个VH亚基的半衰期(图2C)。第四，双特异性纳米抗体可以与其他多肽或蛋白质结合，以制备多特异性纳米抗体。例如，两个双特异性纳米抗体可以连接到两个Fc片段，产生一个半衰期较长的二价、双特异性同源二聚体复合体(图2D，左)。此外，Fc片段也可以用来将一个VHH与一个scFv片段偶联以产生双抗(图2D，中间)。在这些应用中，Fc片段与Fc受体相互作用，可以增强ADCC或ADCP效应。最后，双特异性纳米抗体可以用作细胞治疗中的“子弹”。例如，双特异性纳米抗体可用于T细胞治疗中嵌合抗原受体(CAR)的设计。这种策略可以克服由于单一抗原阴性的肿瘤细胞的增殖而导致的肿瘤细胞的逃逸和复发(图2E)。然而，双特异性纳米抗体对肿瘤细胞的超高亲和力可能会过度激活效应细胞并导致细胞因子风暴。可能需要微调双功能纳米抗体的亲和力和其特异性之间的平衡，以获得最大的安全性和有效性。

图2 不同设计的双特异性纳米抗体

在生产工艺上，纳米抗体不需要像传统双抗的复杂的设计和生产工艺。通过标准的柔性甘氨酸-丝氨酸连接体即可连接两个特定的VHH以产生双特异性纳米抗体。调整连接肽的长度和功能纳米抗体部分的相对位置可以优化对抗原的构象、特异性和亲和力，以及双特异性纳米抗体的后续有效性。例如，Ablynx研发的Sonelokimab(也称为ALX-0761或M1095)，是采用用甘氨酸-丝氨酸连接体的双特异性纳米抗体，在第一和第二阶段的临床研究中显示出良好的结果，表明这种设计是可行的。另外，骆驼重链抗体的天然铰链也可用作连接纳米抗体的柔性连接物，以抵抗血清中的蛋白酶消化。

综上，双特异性纳米抗体在组装和生产方面有其独特的优势。但是，对靶标潜在生物学的清楚了解仍然是开发双功能纳米抗体药物的前提和主要障碍。此外，需要对双功能纳米体抗的结合表位、连接体和支架进行广泛的优化，以实现最大的疗效和最小的副作用。发展多价、多功能的纳米抗体是对双特异性纳米抗体的补充，是未来值得探索的方向。

结 语  

来源于骆驼科动物的纳米抗体在蛋白质结构研究、医学诊断和疾病治疗中已成为强有力的工具。由于纳米抗体对靶标具有高度的构象特异性，与非构象选择性的高亲和力结合物相比，这种纳米抗体可能具有独特的价值，特别是在疾病的诊断和治疗方面。非注射的纳米抗体仍处于发展阶段，许多问题需要在实践中加以评估和克服。最后，作为一项前沿技术，在评估纳米体的临床前模型和策略的选择上仍然存在许多挑战。总之，纳米抗体在科学研究和临床应用中提供了独特的优势。随着这项技术的快速进步，在不同环境下遇到的许多挑战将得到解决，纳米抗体的潜力在未来将得到充分展示。

文献来源：

[1] Rasmussen SG, Choi HJ, Fung JJ, Pardon E, Casarosa P, Chae PS, Devree BT, Rosenbaum DM, Thian FS, Kobilka TS, Schnapp A, Konetzki I, Sunahara RK, Gellman SH, Pautsch A, Steyaert J, Weis WI, Kobilka BK. Structure of a nanobody-stabilized active state of the β(2) adrenoceptor. Nature. 2011 Jan 13;469(7329):175-80. doi: 10.1038/nature09648. PMID: 21228869; PMCID: PMC3058308.

[2]McMahon C, Baier AS, Pascolutti R, Wegrecki M, Zheng S, Ong JX, Erlandson SC, Hilger D, Rasmussen SGF, Ring AM, Manglik A, Kruse AC. Yeast surface display platform for rapid discovery of conformationally selective nanobodies. Nat Struct Mol Biol. 2018 Mar;25(3):289-296. doi: 10.1038/s41594-018-0028-6. Epub 2018 Feb 12. PMID: 29434346; PMCID: PMC5839991.

 [3]Gai J, Ma L, Li G, Zhu M, Qiao P, Li X, Zhang H, Zhang Y, Chen Y, Ji W, Zhang H, Cao H, Li X, Gong R, Wan Y. A potent neutralizing nanobody against SARS-CoV-2 with inhaled delivery potential. MedComm (2020). 2021 Mar;2(1):101-113. doi: 10.1002/mco2.60. Epub 2021 Mar 4. PMID: 33821254; PMCID: PMC8013425.

[4] Li B, Qin X, Mi LZ. Nanobodies: from structure to applications in non-injectable and bispecific biotherapeutic development. Nanoscale. 2022 May 10. doi: 10.1039/d2nr00306f. Epub ahead of print. PMID: 35535618.