化合物在高通量筛选中的作用

在 1985 年之前，先导物的筛选主要是通过人工进行的，每周处理的样本数量不过几百个，组合化学的出现使得科学家们获取化合物的方式发生了显著变化，他们可以在短时间内合成大量化合物。 更重要的是，随着分子生物学和功能基因组的研究发展，使得新颖靶标大量增加，这种情况下，缓慢的人工筛选已经没有办法满足新药研发的要求，高通量筛选技术的出现大大缩短了先导物开发在药物发现中的时间。如今，一个普通的药学高通量筛选实验室每天筛选的靶标已经超过 10 万个。

高通量筛选技术

高通量筛选 (High throughput screening，HTS) 技术包括机器人技术、液体处理器、数据处理、相当多的软件和敏感的检测系统。它是一种药物发现过程，可以使生化或细胞事件能够重复和快速测试化合物数十万次。 HTS 可根据待测样品的种类大致分为细胞水平筛选和分子水平筛选两类。细胞水平筛选是在细胞个体水平上完成的检测，由于含有诸如信号传导、物质代谢等关于细胞生命活动的信息，因此可以省去体外筛选中的许多步骤。 下面将围绕细胞水平筛选介绍几种常用的检测方法：离子通道检测、报告基因检测和细胞增殖检测

离子通道检测

离子通道是目前药物发现的重要靶点。例如在心血管疾病中，离子通道检测可以应用于原发性电障碍 (长 QT 综合症、短 QT 综合症、Brugada 综合症) 等方面的药物筛选。 以 Novel KCNQ2 channel activators discovered using fluorescence-based and automated patch-clamp-based high-throughput screening techniques 一文为例，通过一种改进的高通量筛选技术，筛选新型 KCNQ2 通道激活剂。 在这篇文献中，作者团队以 ZTZ240 (KCNQ2 通道激活剂) 作为阳性对照，通过*通量测定法从 80000 种化合物筛选出了 565 个比 ZTZ240 更强活性的化合物。然后使用 384 孔自动化膜片钳，进一步筛选出了 38 个 KCNQ2 通道激活剂。最后，使用传统的膜片钳表征激活剂，得到 ZG1732 和 ZG2083 (EC50 分别为 1.04 μM 和 1.37 μM)。 

流程：稳定表达 KCNQ2 通道的 CHO 细胞 → 与染料缓冲液共培养 → 在细胞板中加入不同的化合物孵育 → *通量分析初步筛选 → 384 孔全自动膜片钳系统进行撞击验证 → 自动化膜片钳二次筛选。

图 2. KCNQ2 通道激活剂的筛类[5]

报告基因检测

报告基因是一种编码可被检测蛋白质或酶的基因，其表达产物非常容易被鉴定。基于报告基因的高通量检测方法在 Rett 综合征、阿尔兹海默症等其他脑部疾病的治疗上是一个很好的检测方向，另外还可以通过构建报告病毒的方式筛选抗病毒药物。 以 Pharmacological enhancement of KCC2 gene expression exerts therapeutic effects on human Rett syndrome neurons and Mecp2 mutant mice 一文为例，作者团队通过开发建立了一种应用于神经元的高通量筛选方法。该文献中，结合使用了 CRISPR-Cas9 技术，将荧光素酶报告基因插入人 ES 细胞的内源 KCC2 基因位点中，通过检测荧光来筛选特异性增强 KCC2 达的化合物，最终从 900 种化合物中筛选出 14 个 KEECs。 

流程：培养人类胚胎干细胞 (ES 细胞)  结合 CRISPR-Cas9 技术 → 将荧光素酶报告基因插入人 ES 细胞的内源 KCC2 基因位点 → 高通量筛选出能增强 KCC2 表达的小分子 → 6 次重复筛选从 900 个化合物库中筛选出 14 个起作用的小分子 → 通过  Western blot 和 RT-PCR 进行比对验证。

图 3. KEECs 的筛选[6]

细胞增殖检测

细胞增殖检测根据检测内容可以分为四类：ATP 浓度检测、DNA 合成检测、代谢活性检测和细胞增殖相关抗原检测。与细胞增殖检测结合的高通量筛选常用于鉴定能杀死各种癌细胞或病原体的化合物，还可以应用于细胞缺陷疾病的药物筛选。 以 Head and Neck Cancer Stem Cell-Enriched Spheroid Model for Anticancer Compound Screening 为例，作者团队开发了一种程序简单，培养时间短的干细胞富集球形模型 (SCESM)，适用于抗癌症干细胞化合物的新高通量筛选方法 (HTSs)。 

流程：特定细胞培养 7 天 → 含不同实验化合物的处理培养基替代掉一半茎培养液，处理 5 天 → 用 0.5% triton X-100 (Sigma-Aldrich) 在 4℃ 过夜培养 → 用 7-AAD 和 Ki67 共染细胞 → 共聚焦显微镜捕获荧光信号 → 用 qPCR，Flow cytometry，Western blot 验证检测结果。

图 4. 抗癌症干细胞化合物筛选[10]

高通量筛选的实验方法必须具备条件稳定，样本之间差异性小，容易检测，且可以大批量同时检测等特性。除了以上介绍的三种较为常用的方法之外，第二信使检测、细胞活力检测等方法也是常用的细胞水平的检测手段。 化合物库的使用在筛选前期也起着十分重要的作用。在化合物未知的情况下，数量足够大的化合物库可增加识别目标的概率；不同细分用途的化合物库，则能进一步整合具有某项作用的尽可能多的化合物。 MCE 对不同方向、不同种类、性质不同的化合物做了详细分类，如生物活性化合物库、FDA 上市库、天然产物库等可以供不同需求的科学家选择。 随着技术的发展，MCE 化合物库数量会越来越多，分类也越来越精细，这将大大节约前期筛选合适化合物所需的时间。此外，MCE 还可以根据你的不同需求提供定制库~

图 5. 化合物库定制流程

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参考文献

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2. S A Sundberg. High-throughput and ultra-high-throughput screening: solution- and cell-based approaches. Curr Opin Biotechnol. 2000 Feb;11(1):47-53.

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5. Jin-feng Yue, Guan-hua Qiao, Ni Liu, Fa-jun Nan, Zhao-bing Gao. Novel KCNQ2 channel activators discovered using fluorescence-based and automated patch-clamp-based high-throughput screening techniques. Acta Pharmacol Sin. 2016 Jan; 37(1):105-10.

6. Xin Tang, Jesse Drotar, Keji Li, Cullen D Clairmont, Anna Sophie Brumm, Austin J Sullins, Hao Wu, Xiaoxiao Shawn Liu, Jinhua Wang, Nathanael S Gray, Mriganka Sur, Rudolf Jaenisch. Pharmacological enhancement of KCC2 gene expression exerts therapeutic effects on human Rett syndrome neurons and Mecp2 mutant mice. Sci Transl Med. 2019 Jul 31;11(503):eaau0164.

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8. Zhe-Rui Zhang, Hong-Qing Zhang, Xiao-Dan Li, Cheng-Lin Deng, Zhen Wang, Jia-Qi Li, Na Li. Generation and characterization of Japanese encephalitis virus expressing GFP reporter gene for high throughput drug screening. Antiviral Res. 2020 Oct;182:104884. 

9. Peng Wang, Juan-Carlos Alvarez-Perez, et al. A high-throughput chemical screen reveals that harmine-mediated inhibition of DYRK1A increases human pancreatic beta cell replication. Nat Med. 2015 Apr;21(4):383-8. 

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