【行研】持续“进化”的基因编辑技术全球研发进展

基因编辑技术是近几年来蓬勃发展的新兴技术之一，自2012年CRISPR/Cas基因编辑工具问世以来，该技术就获得全球科学家的广泛关注与青睐，之后相关科技成果不断涌现，成功赢得业界无数鲜花、掌声与喝彩。

梳理基因编辑技术发展脉络，迄今已经历了几次迭代升级：第一代是“锌指核酸酶”技术（ZFNs）；第二代是“类转录激活因子效应物核酸酶”（TALENs）；第三代是CRISPR/Cas系统，始于2012年两位诺奖得主的工作；2016年单碱基基因编辑（Base Editor,BE）技术孕育而生，被评为第四代基因编辑技术；2019年引导编辑（Prime Editor,PE）技术崭露头角，再次将基因编辑技术推向新高潮。

下面重点介绍经改良的基因编辑技术——BE和PE：

传统的CRISPR/Cas系统能利用同源定向重组完成精准编辑，但缺陷是效率极低，因此限制了其推广应用。2016年以来基于CRISPR/Cas系统的DNA单碱基编辑技术，能在不产生双链断裂的情况下实现碱基的定向突变，所以具有高效、精准和高特异性等优点。研究表明，传统CRISPR/Cas系统对细胞的编辑效率仅为0.1%-5%，对胚胎仅为70%-80%；而单碱基编辑技术对细胞的编辑效率高达70%-80%,对胚胎甚至可达100%。

BE技术

BE技术分为两类，嘧啶碱基编辑为嘌呤碱基（C/G到T/A）和嘌呤碱基变嘧啶碱基（A/T到G/C）。目前，已开发出了可将C碱基突变为T碱基的胞嘧啶碱基编辑器（Cytidine base editors，CBE）；将A碱基突变为G碱基的腺嘌呤碱基编辑器（Adenine base editors，ABE），其原理基本都是利用CRISPR/Cas系统确定突变位点，并利用脱氨酶催化脱氨（图1）。之所以基于CRISPR/Cas9系统而非ZFNs或TALENs的原因是，胞嘧啶脱氨酶的底物必须是单链DNA,而ZFNs或TALENs无法解开DNA双链，会降低脱氨酶效率。可以预见，将Cas9与其他酶连接在一起构建出种类齐全的DNA编辑工具箱，实现全部核昔酸的替换突变将是今后单碱基编辑技术的发展方向之一。

图1.CBE和ABE结构及原理示意 来源：Nature Reviews Drug Discovery. 

PE技术

PE工具是指可实现碱基任意变换和小片段精准插入和缺失的工具。PE主要借助融合有Cas9切口酶的生物工程逆转录酶和peg RNA（prime-editing guide RNA）。Peg RNA包含一段能引导Cas9切口酶移至靶标序列的互补序列以及额外的目的片段（图2）。Prime编辑器能控制DNA编辑的范围以免发生大范围的碱基转换或突变，取而代之的是小片段的插入或删除，这大大扩展了基因编辑的范围和能力，原则上能纠正89%的人类已知致病遗传变异。

针对PE编辑器，科研人员还相继研发出2.0、3.0以及3.0plus等不同的进阶版本。比如PE2.0是在逆转录酶上引入多个突变，提高酶的逆转录效率，间接优化编辑效率。但因为PE2编辑后的DNA是杂合链（一条是编辑链，一条是非编辑链），而杂合双链错配修复的模板是随机的，编辑效率低的问题。因此，科学家研发出3.0版本，可进一步提高错配修复中编辑链的保留概率，大幅提升编辑效率。解决办法是在非编辑链上再引入一个缺口，使得DNA双链更倾向以完整的编辑链为模板进行错配修复，提高编辑效率。PE3.0 Plus则是降低3.0版本因为引入新缺口而增加插入突变的发生概率，让系统距离完美更进一步。

图2.PE结构及原理示意 来源：International Journal of Molecular Sciences

科学家对基因编辑技术的探索并未停下脚步，创新的技术方法仍持续涌现。2021年4月，美国加州大学旧金山分校和麻省理工学院的研究人员在Cell杂志上发表了一种新型表观遗传基因组编辑工具“CRISPR off”（图3）。该工具的奇特之处是能在不改变遗传密码的情况下，沉默人类细胞中几乎所有的基因并在细胞后代中维持数百代。更值得一提的是，该效应具有可逆性，通过“CRISP Ron”工具能重新激活被沉默的基因。该工具好似发现了人类细胞基因的总开关，意味着未来治疗有望实现“一劳永逸”，仅需一次给药即可实现持久治疗。

图3. CRISPRoff基因编辑工具结构及基因沉默效应

（A图：基于CRISPR技术设计的四种dCas9融合蛋白编辑工具结构示意；B图：将编码dCas9融合蛋白和sgRNA的质粒共转染到HEK293T细胞中，该细胞能稳定表达GFP报告基因。转染后2天对转染细胞分类并持续监测GFP报告基因沉默进程；C图：转染后GFP基因随天数推移发生沉默现象） 来源：Cell

在众多领域都能发现基因编辑技术应用的身影。比如医学疾病治疗、农业作物育种、工业微生物设计，尤其在癌症、心脑血管疾病、遗传性疾病等治疗方面可谓成绩亮眼。根据Cortellis数据库，截止2022年6月15日，全球基因编辑相关在研药物69款，其中药物发现阶段16个，临床一期2个、临床二期4个、临床三期1个、临床前期37个。偏中后期在研药物的适应症为莱伯氏先天性黑蒙、β地中海贫血、镰状细胞性贫血、遗传性血管性水肿等疾病。

表1.全球主要基因编辑在研药物

来源：Cortellis

从全球论文发布情况也可侧面反映一个国家/地区对该技术的重视程度和水平地位。截至2020年底，美国的基因编辑SCI论文数量位列全球第一（占全球总基因编辑SCI论文数46.7％），同时位于全球合作网络的中心位置。其次是中国（发文篇数累积5001篇）。此外，美中两国在基因编辑领域也保持了最紧密的科研合作（图4、图5）。

图4.基因编辑SCI发文数TOP30的国家地区

图5.基因编辑SCI发文数TOP20国家或地区合作网络（合作频次超过10次）

来源：世界科技研究与发展

毫无疑问，基因编辑技术作为新兴生物技术，在全球范围内掀起了研发热潮，综合国力排名前列的世界大国都纷纷投入到该技术的研究中，希望占据尖端科技的前沿阵地。不难理解，基因编辑技术将在科研人员的孜孜追求下持续推陈出新，未来的优化方向也将重点集中于以下三方面：提高编辑效率、增强靶向性/特异性以及降低对细胞的扰动。相信基因编辑技术最终会成为人类的福音，让我们翘首以盼。