循环肿瘤细胞检测的现状及发展

恶性肿瘤远处转移是临床上实体恶性肿瘤治疗失败或复发的主要原因之一，而循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cells，CTCs）的存在正是实体恶性肿瘤远处转移的根源，至上世纪末尤其是本世纪初，随着生物学和计算机等技术的突飞猛进发展， CTCs检测和临床应用取得了重大进步，为早期发现肿瘤的复发转移、评估手术、放疗、化学等疗效、判断预后、确定肿瘤分子特征、选择合适的个体化治疗等方面提供了重要的实验室依据。       

今天金宝请来了上海交通大学附属第一人民医院检验科的李莉主任为大家就CTCs分离技术、分析鉴定技术、临床应用作一介绍。      

01 循环肿瘤细胞分离富集技术  

外周血中的CTCs含量极为稀少，对CTCs检测技术的灵敏度和特异性提出了极高的要求，而分离和富集系统对检测外周血的CTCs是非常必要的。  理想的CTCs分离与富集及检测技术应能达到以下六点要求：  

（1）高捕获率或高灵敏度，就是可以将样品中的CTCs尽可能多的分离出来，即至少能够在上亿个血循环细胞中发现一个肿瘤细胞；  

（2）高特异性，要求检测结果准确无误，尽可能降低假阳性或假阴性，目标是分离出来的细胞只有CTCs，其它细胞的含量很少或没有；  

（3）要求CTCs不能被污染，收集到的CTCs可以进行表型和基因型分析；  

（4）高通量，即能在短时间内处理大量样品；  

（5）重复性，回收率高。  

（6）尽可能降低成本。

目前用于临床实验研究的CTCs分离和富集技术非常之多，但目前来说仍没有理想的方法，每种单独的方法都有自己的优势和缺点。  虽然两种或三种方法的结合有可能成为较为理想的方法，但近十几年的研究进展不大。  主要技术包括密度梯度离心法（Density Gradient Centrifugation，DGC）、细胞过滤技术（Isolation by Size of Epithelial Tumor Cells，ISET）、细胞粘附技术（Cell adhesion techniques，CAT）、免疫磁珠分离技术（Immunomagnetic separation，IMS）、纳米基质分离技术（Nanoimprint matrix isolation technology）、微流控芯片技术（Microfluidic chip technology）。

02 循环肿瘤细胞检测技术  

经过上述方法分选富集的CTCs需要进一步分析鉴定，选用特异性的检测技术或方法对CTCs及其分子进行确认是循环肿瘤细胞检测的重要步骤。常用的鉴定检测技术包括免疫细胞化学技术（Immunocytochemistry，ICC）、逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、荧光原位杂交技术（Fluorescence In Situ Hybridization，FISH）和流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）等。

03 循环肿瘤细胞检测的临床应用  

2007年美国临床肿瘤协会（ASCO）首次将CTC纳入肿瘤检测标志物，CTCs作为一种全新的肿瘤生物标志物。但必须认识到：自2004年美国强生公司Veridex开发的Cellsearch CTC检测技术获得美国FDA认证以来，其它众多厂家推出的循环肿瘤细胞检测仪器都未获得相关认证或准入，目前，更多的报道尚处于临床研究阶段。

CTCs的检测对乳腺癌预后判断、监测病情和早期发现微转移等具有重要临床意义。  Biggers等检测了41例早期乳腺癌患者，其中10例（24.4%）在术前已可检测到CTCs。  研究表明，转移性乳腺癌患者在治疗前、治疗中和治疗后的CTCs水平均与其预后密切相关，CTCs可作为转移性乳腺癌患者独立的预后因子。

临床上结直肠癌的CTCs检测主用是针对于上皮细胞EpCAM标志以及标志物CKl9、CK20、CEA等。  研究发现，CTCs对结直肠癌早期诊断具有潜在的应用价值，在结直肠癌早期患者外周血中就能检测到CTCs，提示CTCs检测对结直肠癌的诊断有所帮助。  CTCs的存在与肿瘤原发灶分化程度无相关性，但与其临床分期具有相关性。

CTCs在局限性前列腺癌的临床应用中目前仍存在一定争议，但在进展和转移性前列腺癌的临床应用中得到广泛认可。  目前，传统的血清学标志物如AFP、CAl9-9、CEA、CAl25的联合检测不能早期反映肿瘤的转移情况，而CTCs的特异性和敏感性均高于传统方法。  2004年Vona等首先利用ISET法对44例肝细胞癌患者进行了CTCs检测的临床应用的研究。  44例患者中，有23例检出了CTCs，检出率为52%，而在健康志愿者、慢性活动性肝炎及肝硬化患者中未检出CTCs。

肺癌的早期发现、早期诊断一直是困扰着临床的难题之一。  在早期肺癌（肿瘤直径小于0.1cm），其外周血中就可检出CTCs，可为肺癌的早期发现及诊断提供重要依据。  Allard等采用Cellsearch系统检测了99例肺癌患者（大多为NSCLC）的168个样品，结果显示，肺癌患者外周血中CTCs数目≥2、≥5、≥10和≥50的患者分别占总患者的20%、14%、10%和6%，平均60%的肺癌患者外周血中存在CTCs。  研究发现，外周血中循环肿瘤细胞存在以及数量与肺癌肿瘤分期具有相关性。

04 循环肿瘤细胞检测的展望  

尽管目前在CTCs研究方面已经取得了很大的进步，但是多种分离富集与检测方法仍难以满足临床实际工作的需要，每种技术的结果难以统一，理论和实践上都需要制定行业技术标准。如何进一步提高CTCs检测敏感性及特异性、发展适应临床CTCs快速诊断需要的高通量、自动化仪器、完善CTCs检测程序及标准化是今后研究的主要方向。CTCs检测的前景不仅仅在于其对肿瘤的诊断、治疗、监测，分选出的CTCs对化疗药物敏感性检测用于指导个体化治疗是临床亟需和期盼的。

作者：李莉  上海交通大学附属第一人民医院检验科主任、主任医师、博士生导师