编译：微科盟HushKuo，编辑：微科盟汤貝、江舜尧。
导读
本研究基于缺氧生物膜和悬浮污泥对NO2-的竞争差异，提出了一种主流系统中稳定富集厌氧氨氧化菌的新策略。研究将实际市政污水在改进的厌氧-缺氧-好氧（A2/O）工艺下运行了500天。微生物分析表明，与悬浮污泥相比，缺氧载体生物膜具有显著更高的厌氧氨氧化菌丰度（qPCR：0.74%-4.34%）（P<0.001）。批量实验表明，缺氧载体生物膜中的厌氧氨氧化菌有助于高效脱氮的同时伴有部分反硝化作用（NO3-→NO2-）。厌氧氨氧化菌属Ca. Brocadia在生物系统悬浮污泥意外损失时高度富集。进一步的批量实验发现，悬浮生物量的减少有助于厌氧载体生物膜中厌氧氨氧化菌的富集，由于悬浮污泥与厌氧氨氧化菌具有强烈的NO2-竞争（NO2-→N2）（通过上调nirK）。宏基因组测序结果显示Ca. Brocadia在缺氧载体生物膜中占主导地位，并且是NO3-→NO2-过程narG的最重要贡献者，这可能促进了与异养细菌的NO2-竞争。该A2/O工艺的低出水总氮（8.9 mg ± 1.0 mg N/L）归因于部分反硝化与厌氧氨氧化的耦合，表明该工艺适用于一般的进水N浓度范围（30 mg-50 mg NH4+-N/L）的市政污水处理厂（WWTP）。基于厌氧氨氧化对NO2-的特殊竞争偏好，该研究为在市政WWTPs中富集厌氧氨氧化细菌提供了一种有前景且实用的选择方案。
原名：Highly enriched anammox within anoxic biofilms by reducing suspended sludge biomass in a real-sewage A2/O process
译名：基于实际污水A2/O工艺中悬浮污泥生物量减量实现缺氧生物膜中厌氧氨氧化菌的高度富集
期刊：Water Research
IF：11.236
发表时间：2021.2.4
通讯作者：彭永臻
通讯作者单位：北京工业大学城镇污水深度处理与资源化利用技术国家工程实验室
A2/O
生物反应器运行了500天用于实际市政污水处理（图1）。在第I阶段（第280天至第325天），反应器以厌氧/缺氧/好氧模式运行。接种载体后，出水NO3--N在1个月内逐渐下降，平均浓度保持在14.1 mg ± 4.0 mg N/L（图1b）。在Ⅱ阶段（第326至442天），由于第326天的操作失误，大量悬浮污泥意外流失（2873 mg VSS/L至534 mg VSS/L，图S2）。污泥流失严重影响了A2/O系统的硝化能力，出水NH4+-N迅速恶化，从1.3 mg N/L变为到31.8 mg N/L（图1a）。在接下来的53天中，硝化性能逐渐恢复，出水TIN浓度在第379天到第442天期间为13.7 mg ± 2.8 mg N/L。为了研究进水负荷对稳定厌氧氨氧化的影响，在第III阶段（第443天至第500天），进水
NH4+-N
从46.1 mg ± 3.7 mg N/L减少到 29.0 mg ± 2.4 mg N/L（图 1a）。调整后，出水TIN浓度迅速下降并保持相对稳定：在接下来的八周内，平均出水NO3--N为7.6 mg ± 1.0 mg N/L（TIN：8.9 mg ±1.0 mg N/L）。整个实验过程使用实际市政污水连续进料，在正常运行条件下，反应器脱氮性能相对稳定。先前的研究表明，当进水NH4+-N约为50 mg N/L时，部分氮损失可归因于厌氧氨氧化，使得脱氮性能高于传统的A2/O工艺。与之前的研究结果不同，本研究中的进水NH4+-N从46.1 mg ± 3.7 mg N/L下降到29.0 mg ± 2.4 mg N/L，但脱氮性能保持稳定且令人满意，表明该工艺适用于市政污水处理厂的一般进水氮浓度范围（30 mg-50 mg NH4+-N/L）。
图1 营养元素去除性能的变化：（a）进水氨氮、出水氨氮以及氨氮去除效率；（b）出水中的硝酸盐、亚硝酸盐和TIN；（c）进水COD/TIN比和TIN去除效率。
为了确定缺氧载体生物膜内的氮转化过程，进行批量实验以模拟具有NH4+-N、
NO3-
-N和乙酸钠的缺氧区（图2a，图S3）。如第448天所示，NO3--N和COD迅速下降，NO2--N显著积累，峰值为13.4 mg N/L。随后，NO2--N和NH4+-N分别以2.6 mg N/L/h和1.4 mg N/L/h的去除速率逐渐减少。当有机物几乎完全消耗时，
NO2--N
和
NH4+-N
继续减少，去除速率分别为0.4 mg N/L/h和0.4 mg N/L/h。在此期间，脱除的
NO2-
-N与NH4+-N之比为1.09，产生NO3--N与脱除NH4+-N之比为0.12，与文献报道的1.14和0.16接近。在这个实验过程中，N2O的比例非常低，可以忽略不计（图S4）。这些结果表明缺氧载体生物膜对硝酸盐-亚硝酸盐的转化比厌氧氨氧化比活性重要，缺氧生物膜具有比NO2-还原速率更高的NO3-还原速率。在实验的初始阶段，
NO2-
-N迅速产生，然后积累而不是立即转化为氮气。NO2--N与NH4+-N之比可以反映厌氧氨氧化活性与反应时间之间的非线性变化，表明有机物的存在影响NO2-竞争。批量实验历时10多个小时，但A2/O系统中缺氧区的HRT要短得多（2.86 h），表明在较低有机物浓度下，适当延长HRT可能会提高厌氧氨氧化的脱氮性能。在不同阶段观察到厌氧氨氧化比活性和对氮损失的贡献随着运行状态（悬浮污泥生物量和进水
NH4+-N
）波动（图2a）。尤其地，批量实验表明，第280天厌氧氨氧化活性为0.17 kg N/m3/d，对脱氮的贡献率为68%。在第430天，缺氧载体生物膜的厌氧氨氧化活性增加到0.17 kg N/m3/d，其对脱氮的贡献为70.6%。除了悬浮污泥的浓度外，其他操作参数无变化，因此缺氧生物膜中厌氧氨氧化活性的增加可能与悬浮污泥的生物量损失有关。当III期进水NH4+-N减少时，厌氧氨氧化活性增加到0.21
kg N/m3/d
（图2a），第462天时去除73.4%的氮。这可能是由传质效率提高、外部生物膜脱落引起。缺氧载体生物膜中的厌氧氨氧化细菌对部分脱氮有积极贡献，如下详述。首先，在不同批量实验的缺氧载体生物膜实验中，厌氧氨氧化贡献了68%-73.4%的氮去除（图2a）。其次，在A2/O系统中，基于质量平衡（表S1），厌氧氨氧化对氮损失的贡献约为29.2% ± 6.7%。在COD/N < 3.0下，该生物系统中的氮去除率（NRR）范围为0.04 kg N/m3/d至0.08 kgN/m3/d，与报道的传统硝化/反硝化工艺性能相当，甚至与污水厌氧氨氧化系统相当（表S2）。第三，经过400天的运行，厌氧氨氧化细菌在缺氧载体生物膜中仍然活跃，这强烈表明在脱氮中不能忽略厌氧氨氧化。此外，氮去除率的提高普遍地归因于厌氧氨氧化生物量的增加。在这项研究中，厌氧氨氧化细菌丰度（图2b）显著高于在先前报道A2/O类似工艺中的水平，这可能有助于提高自养脱氮性能。
图2 （a）不同阶段厌氧氨氧化活性、贡献和生物膜厚度；（b）和（c）分别表示缺氧载体生物膜和悬浮污泥中的厌氧氨氧化菌的基因拷贝数和相对丰度。根据qPCR结果，缺氧载体生物膜中厌氧氨氧化菌的丰度（0.74%-4.34%）（图2b）显著高于悬浮污泥（0.03%-0.08%）（P <0.001）（图2c）。在第I阶段（第280天），缺氧载体生物膜和悬浮污泥中的厌氧氨氧菌丰度分别为2.29 × 109 copies/g干污泥（0.74％）和2.26 ×
107 copies/g
干污泥（0.04％）。当第II阶段悬浮污泥流失时，第430天时缺氧生物膜中厌氧氨氧化细菌丰度增加到最大值1.47 × 1010 copies/g干污泥（4.34%）。减少进水NH4+-N，在第462天，缺氧载体生物膜中的厌氧氨氧化细菌丰度仍然保持在8.35 × 109 copies/g干污泥（2.87%），这与之前的研究一致，并且表明厌氧氨氧化细菌对缺氧载体生物膜具有显著的生态位偏好。这些结果很重要，因为它们证实了厌氧氨氧化细菌可以在高丰度的低氨废水中长期存活。厌氧氨氧化细菌的原位富集以及进一步的长期维护是污水厌氧氨氧化工艺的主要瓶颈之一。以往的研究表明，厌氧氨氧化细菌在传统的全规模市政污水处理厂中普遍存在。根据qPCR结果，本研究中厌氧氨氧化菌的丰度（0.74%-4.34%）与之前接种成熟厌氧氨氧化污泥的系统相当。缺氧载体生物膜中厌氧氨氧化细菌的高丰度解释了正向的自养脱氮。因此，结合前人的研究，本研究的结果表明A2/O系统可以在主流生物系统中持续保持较高水平的厌氧氨氧化细菌丰度。随着悬浮污泥的损失（图1），缺氧载体生物膜中厌氧氨氧化细菌的丰度增加到极高的水平（图2b）。针对厌氧氨氧化的特殊高浓缩工艺，进行了模拟缺氧区（
NH4+
、NO3--N和醋酸钠）的批量实验，设计了三种模式：缺氧载体生物膜、悬浮污泥以及两者的结合。在缺氧载体生物膜中，
NO3--N
和COD的浓度迅速下降，NO2--N显著积累，峰值为15.5 mg N/L（图3a）。NO2--N和NH4+-N随后逐渐减少，去除率分别为2.03 mg N/L/h和0.89 mg N/L/h。相比之下，在悬浮污泥中，由NO3--N还原的NO2--N积累非常少（图3b），
NH4+
-N的下降趋势明显更慢。悬浮污泥和缺氧生物膜共存的结果表明，NO3--N在0.5小时后没有减少，在此期间只有少量NO2--N积累。悬浮污泥的加入增强了亚硝酸盐还原过程（NO2-→N2）（图3c）。这些结果表明缺氧生物膜与悬浮污泥的
NH4+-N
消耗率存在显著差异。批量实验证实悬浮污泥的存在是反硝化与厌氧氨氧化耦合的关键因素，控制悬浮生物量可缩短主流厌氧氨氧化原位富集的调试周期。即，悬浮污泥加强了亚硝酸盐还原（NO2-→N2）作用，削弱了厌氧氨氧化的竞争力。为了进一步了解缺氧载体生物膜和悬浮污泥之间的生态位差异，分析了微生物群落结构。16S rRNA测序所得的厌氧氨氧化细菌丰度的动态变化（图4）与qPCR结果一致（图2）。总的来说，结果（图4）表明Ca. Brocadia是缺氧载体生物膜中已知的主要氮转化功能微生物，而Nitrospira、Dechloromonas和
Nitrosomonas
在悬浮污泥中占主导地位。除了Ca. Brocadia在缺氧生物膜中富集外，Dechloromonas、Azospira和Thauera的比例在悬浮污泥中没有完全恢复（第430天），这与污泥损失前有显著差异（第280天，P <0.01）。这些结果表明悬浮污泥中含有较多的反硝化细菌，较少的厌氧氨氧化菌，而缺氧载体生物膜中的微生物群落结构则相反。出乎意料的厌氧氨氧化菌富集可能是因为悬浮污泥中存活的反硝化细菌比缺氧载体生物膜多。生物反应器中悬浮污泥的损失导致反硝化细菌的急剧减少，NO2-的异养还原减弱。这增强了厌氧氨氧化细菌竞争NO2-的能力和在短时间内进一步增殖的机会。当悬浮污泥增加到以前的水平时，随着进水NH4+-N的减少，缺氧载体生物膜中的厌氧氨氧化菌丰度下降。此外，批量实验和微生物分析再次证实，缺氧载体生物膜对于硝酸盐到亚硝酸盐的转化和厌氧氨氧化活性的维持至关重要。图3 缺氧载体生物膜和/或悬浮污泥批量实验中氮与COD的变化。
图4 缺氧载体生物膜和悬浮污泥中的微生物群落分析（属水平）。5 缺氧生物膜中富集的Ca. Brocadia的基因档案在缺氧载体生物膜中，Ca. Brocadia的丰度在第430天达到最高水平（图2、图4）。宏基因组测序结果（图S5）进一步揭示了物种Ca. Brocadia fulgida（4.14%）和Ca. Brocadia sinica（2.17%）在缺氧载体生物膜中的丰度显著高于悬浮污泥（分别为0.22%和0.13%）（P <0.001）。本研究中Ca. Brocadia的主导地位与在污水厌氧氨氧化系统中观察到的典型属一致，特别是处理实际城市污水时。研究报告称，
Ca. Brocadia
在市政污水处理厂的不同处理单元中始终占据主导地位，而Ca. Jettenia或Ca. Kuenenia通常在处理高强度废水中占主导地位。然而，本研究中Ca. Brocadia的高度富集只是表面现象，需要进一步获取信息研究富集的厌氧氨氧化优势种为Ca. Brocadia而不是其他属的原因。为阐明Ca. Brocadia的富集机制，分析了优势菌中涉及硝化、反硝化和厌氧氨氧化的关键酶（图5，图S6）。对于硝化作用，负责的amoA（470 hits）与Nitrosomonas（438 hits）密切相关，并且仅在悬浮污泥中被观察到（在缺氧载体生物膜中没有），这与微生物群落差异相符（图S5）。考虑到反硝化和厌氧氨氧化的协同过程（图3，图S3），进一步研究了功能细菌的关键酶。反硝化涉及多种氮形式（
NO3-
、
NO2-
、NO、N2O和N2），因此，整个代谢过程需要对酶进行选择。例如，参与硝酸盐到亚硝酸盐过程的narG与多种细菌有关。具体来说，narG在缺氧载体生物膜中主要由Ca. Brocadia（3618
hits
）贡献，而在悬浮污泥中，它主要由Nitrospira（6314 hits）贡献，并且与Dechloromonas的关系最密切（1724
hits
），其次是Sulfuritalea（566 hits）。对于nirS，样品的总丰度几乎没有差异，但其分布主要与悬浮污泥中的Dechloromonas（1472 hits）和缺氧载体生物膜中的Chloroflexi（878 hits）有关。有趣的是，这些结果表明悬浮污泥中nirK的相对丰度比缺氧载体生物膜高2.6倍（表S3），并且主要由悬浮污泥的Nitrospira（1976 hits）贡献。最近的研究表明，Nitrospira具有显著的
NO2-
氧化潜力，悬浮污泥中nirK的上调可能会增加与缺氧载体生物膜竞争NO2-的能力。对于厌氧氨氧化菌，独特的编码基因Hzs与缺氧载体生物膜中优势属Ca. Brocadia（5156 hits）密切相关，但在悬浮污泥中很少检测到Hzs基因（170 hits）（图5）。类似地，Hdh是厌氧氨氧化反应过程中催化中间体肼氧化成氮气的关键酶，其在缺氧载体生物膜中（3264
hits
）也明显高于悬浮污泥中（106 hits）。缺氧载体生物膜中的厌氧氨氧化菌丰度越高，细菌Hzs和Hdh的丰度越高。这些结果与微生物群落分析一致，证实了厌氧氨氧化细菌的生态位偏好。基于编码基因、功能微生物和特定代谢机制，可以了解部分反硝化过程中的NO2-循环。首先，从氮转化基因的角度来看，缺氧载体生物膜中的narG/（nirK + nirS）比值（2.45）高于悬浮污泥（1.75）（表S3），这有利于缺氧生物膜通过
NO3-
还原生成
NO2-
。至关重要的是，nirK在悬浮污泥中含量很高，但在缺氧载体生物膜中几乎不存在。nirK由悬浮污泥的Nitrospira（1976 hits）贡献（图5），而由于无氧条件，缺氧载体生物膜不利于其生长。其次，最丰富的厌氧氨氧化细菌属Ca. Brocadia是缺氧载体生物膜中硝酸盐转化为亚硝酸盐的关键narG贡献者（图5，图S7）。因此，Ca. Brocadia可能会在损失悬浮污泥时促进NO2-的竞争，然后提高其在缺氧载体生物膜中的主导地位。第三，与一些Ca. Brocadia菌株相关联的nrfA基因（876 hits），可以将NO3-还原为NO2-或NH4+与乙酸盐的氧化耦合。因此，厌氧氨氧化细菌将硝酸盐异化还原为铵（DNRA）可能会导致一些氮损失。最后，之前的研究报告称，由于Thauera对NO3-还原的贡献大于NO2-还原，反硝化细菌Thauera在此的作用至关重要。Thauera在缺氧载体生物膜中的增殖速度远高于悬浮污泥（分别为2.94%和1.06%）（图4，图S5），并且在缺氧载体生物膜中比悬浮污泥中含有更多的narG（分别为430 hits与134 hits相比）（图5），表明NO2-供应对厌氧氨氧化的潜在作用。基于上述结果，缺氧载体生物膜的初步概况如图6所示，通过形态学（图S8）、化学（图3a，图S3）和微生物群落分析（图4，图5），描述了Ca. Brocadia的富集机制。厌氧氨氧化代谢需要
NO2-
作为电子受体。在这项研究中，虽然NO2-没有从外部供给到缺氧区，但它可以由缺氧载体生物膜中的NO3-还原产生，并且部分被厌氧氨氧化消耗（图3）。在这些前提条件下，有两个因素进一步加速了厌氧氨氧化的富集：富含nirK/S的悬浮污泥的损失增加了缺氧载体生物膜中
Ca. Brocadia
的NO2-竞争能力（图5）,而与Ca. Brocadia特殊代谢特征密切相关的narG加强了硝酸盐到亚硝酸盐的转化，有助于厌氧氨氧化的快速富集（图5，图S6）。
图5 缺氧区生物膜和悬浮污泥中检测到的氮代谢关键酶的分类学起源。Hdh：肼脱氢酶；Hzs：肼合成酶；AmoA：细菌氨单加氧酶亚基A；NrfA：氨异化亚硝酸还原酶；NarG：细胞质硝酸还原酶α链；NapA：周质硝酸还原酶前体；NirS：细胞色素cd1亚硝酸还原酶；NirK：Cu-亚硝酸盐还原酶；NorB：细胞色素或醌醇依赖型一氧化氮还原酶；NosZ：一氧化二氮还原酶。
图6 A
2
/O系统中的缺氧载体生物膜进行的生化反应（AMX：厌氧氨氧化细菌，主要为Ca. Brocadia；DE：反硝化细菌）。在工程应用方面，当前和以往对A2/O工艺的不同研究为污水处理厂中厌氧氨氧化细菌的原位富集提供了实验基础；包括长期性能、批量实验、微生物群落和功能基因分析在内的实验证据证实了理论基础。由NO3-还原的NO2-可以被厌氧氨氧化菌部分消耗（图3，图S3），特别是在缺氧条件下（例如厌氧或缺氧区）。这种耦合过程也与最近基于厌氧氨氧化的研究中观察到的硝酸盐到亚硝酸盐的反应一致。此外，异养反硝化通常经历NO（一氧化氮）的生产过程，从而为利用NH4+和NO的厌氧氨氧化创造了宏观环境。由于自发富集的发生（非接种），缺氧载体生物膜提高了主流厌氧氨氧化细菌的稳定耐受性。实验室或中试规模的实验通常是通过接种来自侧流或其他生物反应器的成熟厌氧氨氧化污泥来实施的，但在全规模的污水处理厂中直接接种是不切实际的。尽管如此，这项工作为通过厌氧氨氧化的“原位”富集处理市政污水提供了坚实的证据，预计这将在未来的长期实验室规模和中试规模实验中得到进一步验证。悬浮污泥的控制更简单，不需要复杂的多因素控制和高科技的专业管理人员。此外，最近有报道称comammox是传统硝化/反硝化污水处理厂中的主要硝化者（NH4+直接转化为NO3-）。它的存在对连续流动生物系统的好氧区中的稳定亚硝化构成威胁，但它可能有利于通过回流缺氧区进行部分反硝化。这里介绍的工作只是部分厌氧氨氧化方向的冰山一角，未来的研究和工程项目预计将在市政污水处理厂实施。优化缺氧载体生物膜与悬浮污泥之间的协同关系可能有利于提高脱氮性能。宏基因组分析的解释表明这些微生物的潜力并非实际活性，因此进一步研究代谢物水平（RNA或蛋白质）是表征这些微生物（例如Ca. Brocadia、Nitrospira、Thauera）的活性功能所必需的。此外，当缺氧载体生物膜厚度减小时（图2a），悬浮污泥中的厌氧氨氧化细菌丰度增加（图2c），其对氮损失的定量影响需要进一步研究。从更广泛的角度来看，厌氧氨氧化菌不仅参与氮转化，也参与碳代谢，这意味着对复杂环境条件的调控是必要的（例如COD/N、DO、空间模式）。本研究调查了连续流部分反硝化/厌氧氨氧化系统中缺氧生物膜和悬浮污泥的生态位差异。在缺氧区引入生物膜可以在一般进水N浓度范围内（30 mg-50 mg NH4+-N/L）保持相对高丰度的厌氧氨氧化细菌（0.74%-4.34%）。Ca. Brocadia在缺氧载体生物膜中占主导地位，而Nitrospira在悬浮污泥中占主导地位。厌氧氨氧化的意外富集是由于悬浮污泥的突然损失所致。悬浮污泥中维持NO2-快速还原的高nirK，以及与Ca. Brocadia相关的较高丰度narG，可能会进一步强化缺氧载体生物膜内硝酸盐-亚硝酸盐的转化。微生物群落分析和批量实验结果表明，控制悬浮生物量有助于厌氧氨氧化菌富集。基于市政污水处理的部分反硝化，此项工作为厌氧氨氧化菌的原位富集提供了全面理解。
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