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科研 | 重庆医科大学：对来士普治疗有不同响应的抑郁症小鼠的肠道菌群特征（微生物组学+代谢组学）

2021

08/19

微生态

A-

A+

抑郁症是一种常见的异质性精神障碍。虽然目前已有多种抗抑郁药物可用于治疗抑郁症，但影响和预测治疗效果的因素尚不清楚。

编译：微科盟孙元元，编辑：微科盟木木夕、江舜尧。

导读

抑郁症是一种常见的异质性精神障碍。虽然目前已有多种抗抑郁药物可用于治疗抑郁症，但影响和预测治疗效果的因素尚不清楚。本文我们基于16S rRNA测序和代谢组学，研究了慢性不可预测轻度应激(CUMS)小鼠模型在来士普治疗过程中微生物组成和功能的纵向变化。我们发现来士普(ESC)治疗组肠道微生物群落的α多样性增加。应答者(R)和无应答者(NR)组之间的微生物特征有显著差异。与NR组相比，R组主要表现为普雷沃氏菌属UCG-003相对丰度增加，瘤胃菌科和乳杆菌科相对减少。此外我们还鉴定出15种血清代谢物，这些代谢物可以区分R组和NR组。这些差异代谢物主要参与磷脂代谢。值得注意的是，毛螺菌科、幽门螺旋菌科和Muribaculaceae的OTU与血清代谢物形成了很强的共发生关系，这表明肠道微生物群和代谢物的变化是ESC治疗效率的潜在介体。综上所述，我们的研究表明，微生物组成和代谢功能的改变可能与ESC的不同响应有关，这为揭示抗抑郁药物疗效差异的机制提供了新的线索。

论文ID

原名：Characterization of gut microbiome in mice model of depression with divergent response to escitalopram treatment

译名：对来士普治疗有不同响应的抑郁症小鼠的肠道菌群特征

期刊：Translational Psychiatry

IF：6.222

发表时间：2021.5

通讯作者：宋锦璘 & 谢鹏

通讯作者单位：重庆医科大学

实验设计

结果

1. 行为评估

实验方案如图1a所示，我们用蔗糖偏好试验(SPT)和强迫游泳试验(FST)评价小鼠的抑郁样行为。4周CUMS刺激后，我们观察到与对照组相比CUMS组的糖水饮用量明显减少，FST中的不动时间显著增加(图1b)，提示我们CUMS小鼠开始出现抑郁样行为。采用CUMS方案后，我们将动物分为4组：对照组(CON，N=8)、CUMS+载体组(CUMS，N=7)、ESC应答组(R，N=7)、ESC无应答组(NR，N=9)。如图1c所示，与R组相比，NR组的糖水偏好量更低，不动时间更长。这些结果提示我们ESC可以逆转 R 组而非 NR 组的抑郁样行为。

图1 实验方案、流程和行为结果示意图

a，实验流程图；在 CUMS 4 周（b）和来士普给药 4 周后（c）分析小鼠的体重、SPT 中的蔗糖偏好和 FST 中的不动时间（%）。

2. 肠道菌群多样性的动态变化

我们探索了抑郁小鼠肠道微生物组的动态变化。由于样本含量不足导致总共有4个样本被排除在分析之外。在ESC给药前（第0天）和给药后4周（研究结束）总共收集了151个粪便样本。本次测序总共生成了7155561个高质量的 16S rRNA序列，每个样本的平均读数为47387。在将样本稀释到相同的测序深度（每个样本28216个读数）和聚类之后，来自151个粪便样本的4260616个序列被归类于1289个 OTU 中用于下游分析。我们研究了ESC对微生物多样性的影响，并且发现在第4周时NR组和R组的微生物丰富度(包括Chao和Ace指数)都高于对照组(p<0.05)(图2a，b)。仅就ACE指数而言，NR组和R组高于CON组和CUMS组(p<0.05)(图2b)。前3周的群落丰富度和整个治疗期间的群落多样性没有显著变化(图2)。

为了评估肠道微生物区系的β多样性在不同群体之间的变化，我们进行了基于未加权Unifrac距离矩阵的主坐标分析（PCoA）和偏最小二乘判别分析(PLS-DDA)(图2c，d)。我们发现根据ANOSIM检验（R=0.1996，p=0.001，图2c）评估结果，这四组群体被聚类为的具有不同β多样性值的组别。特别是R 组的微生物组成与 NR 组的微生物组成显著不同（R=0.0211，p=0.021，图2d）。

此外，我们还进行了β多样性的动态变化。在前3周，对照组与其他组分离良好(ANOSIM检验p<0.0 1)，但其他三组之间的相似性较高。然而，在第4周，我们从PCoA图中观察到R组和NR组之间的区别趋势，而PLS-DA图显示两组之间有更明显的区别。

图2不同群体的微生物多样性的纵向变化

在第0~4周的不同时间点上用Chao指数(a)和Ace指数(b)表示的细菌丰富度，第4周时NR和R组的细菌丰富度高于CON和CUMS组。数据用均值和标准差表示(p<0.05，Wilcoxon秩和检验)。基于未加权UniFrac距离的主坐标分析(PCoA)图和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)结果表明，在OTU水平上，4个组(c)之间存在明显的聚类，R组和NR组的细菌群落分别聚为一类(d)。

3. CUMS 组与CON组肠道菌群的动态变化

我们首先分析了CUMS刺激的4周中小鼠肠道微生物群的变化。我们发现CUMS 组中厚壁菌门的相对丰度降低，而拟杆菌门增加，在第 4 周时两者的差异最显著。CUMS组的Camplibobacterota一直高于CON组，而CUMS组的放线菌则较低。在科水平上，我们发CUMS组中拟杆菌科、螺杆菌科和Rikenellaceae的相对丰度在所有时间点均高CON组，而Eggerthellaceae和双歧杆菌科在CUMS组中的相对丰度较低。拟杆菌属和双歧杆菌属的丰度变化与科水平一致。这些数据显示CUMS和CON组之间肠道微生物群的组成存在显著差异，这表明CUMS刺激可以诱导肠道稳态的扰动。

4. R组与NR组微生物组成差异

鉴于抑郁小鼠对 ESC 治疗表现出不同的反应，我们认为研究肠道微生物组与对 ESC 反应之间的关联是很有趣的。因此，我们研究了R和NR组之间微生物组成的动态变化。在治疗开始之前，厚壁菌门和拟杆菌门在R和NR组小鼠的肠道微生物群中占主导地位。具体而言，拟杆菌最丰富，其次是厚壁菌门和Campilobacterota(图 3a、d)。在ESC给药2周后，我们发现NR组中的毛螺菌科和瘤胃球菌科的数量显著增加(p <0.05)；R组中乳杆菌科和Eggerthellaceae的丰度一直较低(图 3b、e)。在属水平上，NR组乳酸杆菌含量最高，第1周和第3周差异明显(p < 0.05)。此外普雷沃氏菌属UCG-003在R组中呈上升趋势，而在NR组中稳定在较低水平(图 3c、f)。我们注意到在R和NR组之间的其他优势分类群中没有差异。

图 3 R和NR组微生物组成的纵向变化

堆叠条形图显示了两组小鼠在门（a）、科（b）和属（c）水平上肠道微生物组成的纵向变化。折线图显示了不同阶段优势细菌门（d）、科（e）和属（f）的相对丰度。

5. 与ESC响应相关的差异OTU

为了更深入地了解ESC给药后微生物区系的变化，我们在操作分类单元(OTU)水平上采用线性判别分析效应大小(LEfSe)来比较微生物组成。如图4a中的Venn图所示，R组和NR组共有777个OTU，其中125个为NR所特有，87个为NR所特有。图4b显示R组和NR组之间存在显著差异的34个OTU(p<0.05；线性判别分析[LDA]>2.0)，其中17个OTU 在R组富集，另外17个在NR组中富集。其中，有3个属于毛螺菌属NK4A136的OTU (OTU1262, OTU486, OTU202)和3个属于副拟杆菌属的OTU (OTU555, OTU1023, OTU181) 在R组中富集。4个属于Muribaculaceae的OTU (OTU700, OTU572, OTU510, OTU384)，2 个属于幽门螺旋菌属的OTU (OTU381, OTU320)和2个属于Mucispirillum的OTU (OTU401, OTU999)在NR组中富集。为了进一步研究不同的OTUs是否与抑郁样行为有关，我们将R组和NR组的OTUs与行为指数进行了Spearman相关性分析。OTU213(属于拟杆菌属)与FST中小鼠的不动时间呈负相关(rho=−0.547，p=0.028)，OTU304(属于Colidextribacter)与SPT中小鼠的糖水摄入量呈正相关(rho=0.532，p=0.034)(图4c)。

图4 R组和NR组中OTUs富集情况分析

a，Venn图显示R组和NR组之间的OTUs分布，R组和NR组之间共有777个OTU；b，LEfSe分析R组和NR组粪便样本，以LDA>2和p<0.05的双重标准筛选出的标志性OTUs的热图；c，行为相关的OTU相对丰度的散点图。

6. R和NR组之间血清代谢特征差异

鉴于肠道微生物群经常调节宿主的代谢途径，我们采用基于GC-MS的代谢组学方法对R组和NR组的代谢特征进行了比较。如图5a所示，R组和NR组共有15种代谢物为差异代谢物(VIP>0.1，p<0.05)。在R组中富集的代谢产物包括L-天冬氨酸、2-氨基苯甲酸、豆甾醇、1-单油酸、氨丁三醇、磷酸乙醇胺、L-半胱氨酸-甘氨酸。而在NR组中富集的代谢产物包括1-单硬脂素、乙醇磷酸、α-生育酚、3-羟基异戊酸、草酸、绿原酸、肾上腺素和乙醇胺。这些差异代谢物主要参与磷脂代谢(磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱的生物合成)(图5b)。总之，血清代谢分析表明对ESC的响应差异是以磷脂代谢紊乱为特征的。

7. R组和NR组肠道菌群与血清代谢物的共发生网络分析

为了研究肠道细菌变化与血清代谢物之间潜在的相互作用，我们基于Spearman相关性分析构建了一个共发生网络。我们发现属于毛螺菌科的6个OTU (OTU486、OTU810、OTU1262、OTU76、OTU354、OTU202)与血清代谢物豆甾醇有很强的共发生关系。2个OTU (OTU76属于毛螺菌科，OTU1123属于Rikenellaceae)与L-天冬氨酸呈正相关(图5c)。值得注意的是，有3个属于幽门螺旋菌的OTU (OTU381，OTU510，OTU320)和4个属于Muribaculaceae的OTU (OTU384，OTU572，OTU700，OTU510)与在NR组中富集的的血清代谢物有很强的共发生关系。此外，在R组富集的7个OTU (OTU354、OTU1023、OTU202、OTU213、OTU486、OTU555、OTU810)与肾上腺素呈负相关(图5c)。这些结果表明肠道微生物区系和代谢产物的改变在R组和NR组之间形成了协同和节点相关的共发生网络。

图5 R组和NR组血清样品的代谢组学分析

a，基于R组和NR组差异代谢物的热图，分别有7和8个代谢物在R组和NR组中富集；b，差异代谢物的途径富集分析，磷脂酰乙醇胺的生物合成是主要的代谢途径；c，重要的OTU和代谢物之间的相互作用网络。节点的大小代表丰度，不同颜色的节点代表代谢物(蓝色)和OTUs(橙色)，灰色线条表示负相关，橙色线条表示正相关，线条的粗细反映了相关性的强弱。

讨论

本研究基于16S rRNA测序和代谢组学方法，研究了ESC治疗后CUMS小鼠模型肠道微生物区系和血清代谢产物的动态变化。我们发现ESC应答者和非应答者群体具有不同的微生物组成和代谢途径。R组的特征是丰富的普雷沃氏菌属UCG-003，贫乏的乳杆菌科和Eggerthellaceae。此外，分属于乳螺科、Muribaculaceae和螺杆菌科的OTUs与磷脂代谢有关的血清代谢物形成了很强的共发生关系。我们的结果表明肠道微生物群可能参与调节ESC治疗的临床响应，这可能是通过不同的微生物群移动轨迹和微生物区系与代谢物之间的相互作用来介导的。

在本研究中，ESC可以减轻应答组CUMS小鼠的抑郁症状(增加SPT中的蔗糖偏好率和减少FST中的不动时间)，而不能减轻无应答组的抑郁症状。根据16S rRNA测序结果，与对照组相比，NR组和R组的微生物丰富度(Chao指数和Ace指数)在4周时都很高，并且在整个处理过程中都有增加的趋势。这些发现表明，ESC的疗效可能归因于肠道微生物群α多样性的增加。先前的研究发现，包括质子泵抑制剂 (PPI) 和二甲双胍在内的几种常用非抗生素药物可以改变肠道微生物组的组成和功能，而抗抑郁药如选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(SSRIs)和三环类抗抑郁药(TCAs)对肠道微生物组的α多样性没有影响。最近的一项研究表明，除地塞帕明外，其他五种抗抑郁药都降低了微生物群落的丰富度，但不影响其多样性。这一发现与我们的结果不一致，这可能是由于药物和治疗时间的不同，需要更多的实验来验证。我们的结果显示四组间细菌多样性均有显著差异，其中R组与NR组差异明显。该结果与我们先前的研究一致，MDD受试者的肠道微生物组成与健康对照组不同。先前的研究还报道了与抗PD-1单克隆抗体疗效相关的患者肠道菌群组成的差异。此外，我们还研究了四个群体的β-多样性的纵向变化。在前 3 周只有对照组与其他组分开，而在第 4 周观察到 CUMS、R 和 NR 组之间的区分趋势，这表明β-多样性是随着治疗期的动态变化。而且在第4周观察到R组和NR组之间更明显的区别。

我们还分析了微生物组成的动态变化，发现CUMS诱导的小鼠肠道菌群在不同时间点的演替模式不同。1周后CON组的优势菌族厚壁菌的丰度高于CUMS组，而拟杆菌则呈现相反的趋势，这与我们之前的研究结果一致，即MDD患者的拟杆菌数量高于HC。据报道厚壁菌有能力通过将碳水化合物发酵成各种短链脂肪酸来防止肠道屏障功能障碍，而健康个体中厚壁菌的丰度更高。CUMS小鼠体内微生物组成的紊乱与应激导致微生物失调的已有报道是一致的。

以上结果表明，CUMS过程影响肠道微生物结构，而抑郁小鼠对ESC给药的反应不同，这促使我们探索微生物结构的显著变化是否与ESC效率有关？因此，我们研究了R组和NR组在ESC给药的不同阶段肠道菌群的变化。在门的水平上，在第3周时发现R组和NR组的厚壁菌和拟杆菌的丰度存在差异，到第4周时差异消失。在给药2周时，NR组的瘤胃菌科丰度明显增多，并且随着时间的推移保持稳定。有趣的是，我们发现R组在治疗开始至第4周时，乳杆菌科的水平较低，而乳杆菌属也表现出类似的变化趋势。乳酸菌通常被认为是有益的参与者，可以预防炎症并保护肠道免受多种病原体和细菌的侵袭。然而，最近在人类和动物研究中发现的乳酸菌也提到它可能与几种疾病有关。因此乳酸菌对药物效率的影响值得进一步研究。R组中普雷沃氏菌属UCG-003丰度高于NR组，但差异不显著。更高水平的普雷沃氏菌属UCG-003有可能通过产生琥珀酸激活树突状细胞来调节肠道炎症。因此普雷沃氏菌属UCG-003可能在免疫炎症系统中发挥积极作用，从而影响ESC的疗效，减轻小鼠的抑郁行为。

为了深入研究R组和NR组之间是否存在差异的特定微生物群落，我们在OTU水平上对微生物组成进行了比较。结果显示NR组独有125个OTU，R组独有87个OTU，R组与NR组共有777个OTU。基于Lefse算法分析，我们发现了17个R组中富集的OTUs和17个NR组中富集的OTUs。3个属于毛螺菌属NK4A136的OTU和3个属于副拟杆菌的OTU在R组中富集。毛螺菌科被认为通过产生抗炎单链脂肪酸对宿主健康有益，并有助于维持肠道屏障的完整性。副拟杆菌已被证明通过改变大脑中的神经递质水平，包括海马中的谷氨酸和GABA，在神经系统疾病中提供了保护作用。而NR组中则富集了幽门螺旋菌属的2个OTU(OTU381、OTU320)。据报道幽门螺旋菌能刺激免疫低下小鼠的促炎细胞因子如Th1和Th17的反应。先前的研究表明，炎症可能导致抗抑郁药无响应的原因之一。在R组富集的OTUs中，OTU304(属于Colidextribacter)与抗抑郁样行为(SPT中的蔗糖摄入量)呈正相关。我们的数据证明特定的肠道微生物分类群可能是抗抑郁药物治疗响应的一个标志。

以前的实验已经发现抑郁症的特征包括代谢物水平的紊乱，但抗抑郁药物治疗中涉及的代谢变化还没有被研究。在本研究中我们观察到R组和NR组之间的血清代谢组学紊乱。血清代谢物图谱显示，R组和NR组之间有15种代谢物存在差异表达。这些差异代谢物主要参与磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱的生物合成。共表达网络显示OTU的变化与不同的代谢物密切相关。我们发现5种在R组富集的OTUs与豆甾醇呈正相关。已有研究观察了豆甾醇的抗抑郁作用，以及对神经递质系统的影响，及其与抗抑郁作用有关的机制。豆甾醇被发现能抵抗细菌降解，然而其与肠道微生物区系相关的代谢机制仍然知之甚少。有趣的是，我们还发现7个在R组中富集的OTU与肾上腺素呈负相关，3个在NR组中富集的OTU与肾上腺素呈正相关。来士普作为一种SSRI，它与肾上腺素能受体的亲和力很低。NR组肾上腺素水平升高可能与下丘脑-垂体肾上腺轴过度活跃或肾上腺素代偿性升高有关。这些发现表明肠道微生物群落的紊乱可能通过诱导代谢途径紊乱导致小鼠对ESC的响应不同。在未来的研究中，这些参与磷脂代谢的代谢物与肠道微生物区系之间的相互作用有待深入研究，以阐明它们在抗抑郁药物疗效中的潜在作用。

需要注意的是，这项研究也存在一些局限性：(ⅰ)与所有实验模型一样，使用CUMS小鼠抑郁症模型来概括人类抑郁症的病理生理学必须考虑到局限性，在将小鼠数据转化为人类研究之前，还需要进一步的研究；(ⅱ)由于样本量有限，代谢组学分析仅在R组和NR组进行；(ⅲ)与不同肠道微生物相关的血清代谢物在抗抑郁反应中的作用需要进一步验证。

综上所述，我们阐明了对来士普治疗有不同响应的CUMS小鼠肠道菌群的动态变化特征及其与代谢产物的关系。我们观察了药物应答组和无应答组之间微生物群变化的不同轨迹。在NR组中富集的瘤胃菌科、乳杆菌科和在R组富集的普雷沃氏菌属UCG-003等肠道菌群可能用于预测抗抑郁药物的治疗效果。此外，我们的研究结果还显示，在R组中富集的属于毛螺菌科的OTUS与豆甾醇呈正相关，提示肠道微生物群与代谢组之间可能存在双向影响，可能影响抗抑郁治疗效果。我们的研究显示了肠道微生物区系作为治疗靶点的潜力，相关的细菌分类和代谢变化可以作为一种调节策略，为抑郁症提供更好的治疗选择。