科研 | Sci Total Environ：上世纪肠球菌中金属和抗生素抗性基因多样性反映重叠生态系统中菌门间多重污染和遗传交换

编译：微科盟温水，编辑：微科盟木木夕、江舜尧。

1. ArsA（抗砷基因）蛋白的分布和相关操纵子的鉴定（包括已发表基因组与野外分离株）

计算机模拟分析发现13个ArsA系统发育分组（同源性<95%；ArsA_I到ArsA_XIII；蛋白质大小从574到580个氨基酸不等），包括来自151个肠球菌基因组的177个蛋白质序列，其中4%（3547个基因组）应用于基因组分析（1906-2015年；来自欧洲、亚洲、美洲和大洋洲）（图1；表S1）。ArsA的阳性基因组分别属于粪肠球菌（42%-n=63/151;25 STs）、屎肠球菌（40%-n=60/151;24 STs）和其他肠球菌（19%-n=28/151），它们大多来自动物/食用动物生产环境，以及食品/食品加工样品（69%-n=104/151）（p<0.05）（表S1；图1）。

常见的ArsA变型为ArsA_I（38%-n=67/177）和ArsA_II（47%-n=84/177）与粪肠球菌和屎肠球菌相关（ArsA_I为63%-n=42/67和33%-n=22/67；ArsA_II为52%-n=44/84和46%-n=39/84），而与其他物种（ArsA_I为n=3，ArsA_II为n=1，p<0.05）。ArsA_Ⅲ到ArsA_XIII（15%-n=26/177）多见于11种很少引起人感染的肠球菌（96%-n=25/26）。在变型ArsA_I+ArsA_II（17%-n=25/151个基因组）和变型ArsA_IX+ArsA_X（n=1个基因组）中观察到两个ArsA变体共存。ArsA_I、ArsA_II、ArsA_III或ArsA_V还分布于其它7个Firmicutes（厚壁菌）菌属（n分别为3、3、2和1个），其中3个与Listeria monocytogenes菌有关（表S4）。大多数已鉴定的Firmicutes与特定环境有关，比如与动物或人类的流行病相关的食物链。

所鉴定的ArsA变型包括在肠球菌间异质的完整型或截短型As操纵子，如前所述（图S2）。ArsA_I和ArsA_II基因通常在同一操纵子中（47%-n=14/30个携带ArsA_I或ArsA_II），位于先前提到的Listeria monocytogenes菌基因组岛2（LGI2）的遗传元件中。该操纵子含有重复的arsR、arsd和acr3基因。在一些分离株和LGI2的替代遗传环境中观察到该操纵子的截短版本，其中arsDII和大部分ArsA_II基因被删除（图S2-D）。ArsA_I还与携带一簇截短ArsARD基因以及另一种编码N-乙酰基转移酶的操纵子变体（图S2-B）。这些操纵子变异多见于粪肠球菌和屎肠球菌（97%-n=29/30），并与与ArsA_III到ArsA_XIII相关，通常携带arsRDacr3基因（41%-n=9/22），或重复的arsD、acr3基因。特别地，变体ArsA_V、ArsA_VI、ArsA_VII、ArsA_IX、ArsA_X、ArsA_XI、ArsA_XII或ArsA_XIII也携带arsC基因（图S2-H）。编码AS外排转运蛋白的acr3或arsb基因在ArsA_IV、ArsA_X、ArsA_XII或ArsA_XIII的操纵子中发生缺失或截断，因此这些操纵子不一定具有As抗性（图S2-H）。

381个野外分离株中ArsA_I和ArsA_II基因最多见，其与已发表基因组的鉴定结果相似（表S8）。肠球菌中ArsA_I和ArsA_II的检出率为7%。检出的ArsA_I占70%（n=19/27），ArsA_Ⅱ占56%（n=15/27）。在7株ArsA阳性分离株中发现ArsA_I和ArsA_II基因同时存在（n=27/381，大多为屎肠球菌和粪肠球菌）。ArsA阳性分离株主要来自动物生产环境或食品（52%-n=14/27和41%-n=11/27）（p<0.05）。

2. MerA（抗汞基因）蛋白的分布和相关操纵子的鉴定（包括已发表基因组与野外分离株）

由116株肠球菌分离株（1906-2018年；来自欧洲、亚洲和美洲）的123个蛋白质序列组成6个MerA系统发育分组（同源性<95%；MerA_I到MerA_VI；蛋白质大小从425到631个氨基酸不等），构成3547个占比3%的基因组（图2；表S2）。它们在屎肠球菌（69%-n=80/116；36 STs）比粪肠球菌（22%-n=25/116；10 STs）或其他种类（9%-n=11/116）中更常见（p<0.05）。大多数基因组属于人类分离株（50%-n=30/116个临床分离株，n=28/116个健康人粪便分离株）（p<0.05），其次是动物/动物生产环境、食品/食品加工样品分离株（34%-n=39/116）和其他来源的分离株（4%-n=5/116）。与其他变体相比，MerA_IV蛋白最多见（46%-n=57/123），尤其是在屎肠球菌中（p<0.05）（表S2；图2）。MerA_II也与屎肠球菌的相关性较强（73%-n=29/40；p<0.05）。在两种动物来源的屎肠球菌中观察到MerA_II+MerA_IV或MerA_IV+MerA_V共存。尽管69%（n=20/29）带有MerA_II的屎肠球菌属于人类感染相关的克隆谱系（分枝A1），但由于其中一些来自同类型的感染，因此需要谨慎分析。

与MerA_I、MerA_III和MerA_VI相对应的系统发育类群主要属于粪肠球菌，多来自临床或健康人群（p<0.05）。MerA_I和MerA_VI共同出现在5个相同背景来源的产β-内酰胺酶粪肠球菌（ST9和ST10）中，其主要与20世纪80年代末美国住院儿童有关。MerA的系统发育蛋白变体在还分布在其他细菌中，比如大多属于Firmicutes（厚壁菌门；n=35；所有的MerA变型），其次为Proteobacteria（变形菌门；n=6；MerA_I、MerA_II、MerA_V）、Actinobacteria（放线菌门；n=25；50个属）；MerA_IV仅在Listeria monocytogenes菌和Lactobacillus malefermentans菌中检测到，其中分别在6、12、10和4个属中检测到MerA_I、MerA_II、MerA_III和MerA_VI（表S5）。它们与不同的生态环境有关，如与人类或动物微生物区系或感染相关（MerA_I、MerA_II、MerA_V、MerA_VI）以及与动物食物链相关（MerA_IV）。

所鉴定的MerA变体存在于肠球菌中高度异质的完整或截短的Hg操纵子中（图S2）。其中，MerA_I基因是整合到Tn5385汞操纵子中的一部分，但还没有检测到该转座子中编码Mera_VI变体的第二个基因（图S2-A）。另外，该操纵子携带MerB裂解酶、转运蛋白基因和其它调节子。与MerA_III相关的Hg操纵子也携带携带转运蛋白基因和调节子，在Casselivisus664.1H1中曾有描述（图S2-D）。与MerA_II、MerA_IV或MerA_V相关的Hg操纵子仅携带编码还原酶和调节因子的基因，其中一些（MerA_II或MerA_V）在Streptococcus spp.中曾有描述。三个Hg操纵子变体（携带MerA_II、MerA_III或MerA_V）被推测为II型ISL3转座子包围（图S2-B、C、D、E）。与MerA_IV变异相关的Hg操纵子似乎位于含有ISs和酪氨酸重组酶的高度重组区域（图S2-E）。

381个野外分离株中MerA基因的检出率为18%（n=67/381；81%在粪肠球菌中，n=54/67）（表S8）。它们主要包括MerA_II（48%-n=32/67）和MerA_IV（33%-n=22/67），其次为MerA_V（16%-n=11/67）和MerA_III（12%-n=8/67）。与基因组数据库分析结果相似，MERA_Ⅱ、MerA_IV和MerA_V主要与屎肠球菌分离株（95%-n=54/57）相关（p<0.05），而变型MerA_Ⅲ仅在粪肠球菌中发现。在3株屎肠球菌中发现MerA_Ⅱ+MerA_IV或MerA_IV+MerA_V共存。多数MerA阳性肠球菌来自人类分离株（58%，n=30/67来自健康人群，n=9/67来自临床分离株）（p<0.05），其次来自动物或动物生产环境以及食品（36%，n=24/67）。

图1. 151株NCBI已发表的ArsA（抗砷基因）耐药性Enterococcus（肠球菌）的系统发育树。采用最大似然法，由Salmonella TyphimuriumpR46（序列号：NC_003292）构建。分离株（ArsA_I: E. faecalisH120; ArsA_II: E. faecium SN71）加粗表示。分支点数字表示迭代次数（1000次重复），只显示大于70%的值。蛋白质同源性在64-100%之间，蛋白质大小在574-580个氨基酸之间。当氨基酸同源性小于95%时，可定义为不同的arsA系统发育类群。“Human, unknown sample”分离株纳入“健康人监测”组。利用iTol软件（https://itol.embl.de）构建发育树，用不同颜色标记每个分离株的蛋白变异和来源。所有分离株的流行病学背景见表S1。

图2. 116株NCBI已发表的MerA（抗汞基因）耐药性Enterococcus（肠球菌）的系统发育树。采用最大似然法，由Hidrogenobacterthermophilus TK-6（序列号：ADO45702.1）构建。分离株（MerA_II: E. faecalisKE10C1; E. faecium SN504/E. faecalis612T/E. faecium VE40C2/E. faecium SN71/E. faecium M410399; MerA_III: E. faecalis H107; MerA_IV: E. faecium SN71/E. faecium SN592;MerA_V: E. faecium C460/E. casseliflavus SN65）加粗表示。分支点数字表示迭代次数（1000次重复），只显示大于70%的值。蛋白质同源性在64-100%之间，蛋白质大小在425-631个氨基酸之间。当氨基酸同源性小于95%时，可定义为不同的MerA系统发育类群。利用iTol软件（https://itol.embl.de）构建发育树，用不同颜色标记每个分离株的蛋白变异和来源。所有分离株的流行病学背景见表S2。

3. TcrB（抗铜基因）蛋白的分布和相关操纵子的鉴定（包括已发表基因组与野外分离株）

所有的TcrB序列都聚在一个系统发育分支中（TcrB序列的同源性≥95%；蛋白质大小为690-740个氨基酸），这些序列源于285个肠球菌，相当于3547个可用基因组中的8%（1900-2019年；来自欧洲、非洲、美洲、亚洲和大洋洲）。TcrB蛋白主要存在于屎肠球菌中（65%-n=185/285，63 STs；p<0.05），其次是粪肠球菌（27%-n=76/285，36 STs）以及其他菌（8%-n=24/285）。它们来自不同的环境，大多来自动物或动物生产环境以及食品（67%-n=190/285；p<0.05）（图3；表S3）。通过与GenBank数据库中现有细菌基因组对比，发现TcrB分布于6个Firmicutes（厚壁菌）菌属中（对应于具有700、710和740个氨基酸的肠球菌蛋白质）（表S6）。它们通过食物链传递，普遍与动物和人类传染病相关。

肠球菌中TcrB基因被整合到Cu操纵子tcrYAZB中，其常被IS3-like和IS6-like包围，呈现出一个同质组织（图S2-C、E、F）。在大多数情况下（89%-n=24/27），它与另一组与铜耐受相关的基因相邻，如前人所述，该基因由一个重金属基因、一个多铜氧化酶（CueO基因）、一个转录调节因子和一个组氨酸激酶组成。然而，在本研究的3个基因组（E.gallinarum、E.mundtii、E.casseliflavus）中，有一组基因不与操纵子tcrYAZB相邻。

我们收集到381个野外分离株，为了与可用基因组的TcrB对比，我们选择了23%（n=87/381）的TcrB阳性分离株进行分析，这些分离株主要为屎肠球菌和粪肠球菌（分别为69%-n=60/87和21%-n=18/87）（表S8）。结果发现，本研究的TcrB主要与食用动物生产环境和食品相关（54%-n=47/87；p<0.05），而非其他环境（人类，34%-n=30/87；水生环境，12%-n=10/87)。

图3. 285株NCBI已发表的TcrB（抗汞基因）耐药性Enterococcus（肠球菌）的系统发育树。采用最大似然法，由Enterococcushirae F1129E_113（序列号：OQO45776.1）构建。分离株（E.faecium SN592; E. faecium SN504; E. faecium VE40C2; E. faecalis 712T; E.faecalis 697T; E. faecalis 612T）加粗表示。分支点数字表示迭代次数（1000次重复），只显示大于70%的值。蛋白质同源性在96-100%之间，蛋白质大小在690-740个氨基酸之间。“Human, unknown sample”分离株纳入“健康人监测”组。利用iTol软件（https://itol.embl.de）构建发育树，用不同颜色标记每个分离株的蛋白变异和来源。所有分离株的流行病学背景见表S3。

4. 在过往120年中，屎肠球菌和粪肠球菌中一直存在MeT基因（金属抗性基因），而ABR基因（抗生素抗性基因）从1960年后逐渐增加

对携带MeT基因的屎肠球菌和粪肠球菌的361株公开基因组进行计算机模拟分析，结果发现，从20世纪初到2019年，MerA、ArsA和TcrB基因波动变化（图4）。大多数分离株只携带与一种MeT基因（74%-n=267/361），少数分离株携带不同组合的MeT基因（TcrB+MerA，10%；TcrB+ArsA，9%；ArsA+MerA，2%；TcrB+MerA+ArsA，5%）。

所有的MeT基因都在20世纪被检测鉴定，然而，直到20世纪60年代才鉴定到ABR基因。自此，粪肠球菌和屎肠球菌被发现会积累不同的抗生素抗性菌群，热图显示，有61%（n=220/361）的菌株含有3种或3种以上的ABR基因（图4）。1960年后，MeT基因阳性的肠球菌基因组中检出对氨基糖苷类、四环素类、大环内酯类或林可酰胺类的ABR基因，直至1990至2010年，万古霉素（vanA、vanB）和利奈唑胺（cfr、poxtA、optrA）的ABR基因才被检出。大多数MeT阳性基因组中普遍分布于MDR分离株中（ArsA、MerA和TcrB比例为50%、65%和66%）。比如MeT阳性的粪肠球菌和屎肠球菌野外分离株中能检出MDR分离株（ArsA、MerA和TcrB比例为70%、49%和68%）。

图4. 热图显示从GenBank数据库检索的已知的分离日期的屎肠球菌（n=230）和粪肠球菌（n=131）基因组中同时存在抗生素抗性（ABR）和金属抗性（MeT）基因。为了清晰起见，我们删除了缺失ABR和MeT基因（ArsA_III-ArsA_XII，aac 6′-Iid，aac 6′-Iih，vanE，vatB，vgaB）的基因组。行和列分别按类别和年代排序。在热图上，行对应于ABR和MeT基因，并根据子类别着色。列以类别和子类别手动注释。根据NCBI和Patric数据库注释对屎肠球菌和粪肠球菌的基因组、物种和分离株来源。该热图是使用在线Morpheus web-server生成。

5. As（砷）、Hg（汞）、Cu（铜）抗性基因往往在高重组潜力的遗传平台上相互关联

MeT的基因变体位于89%的野生分离株的质粒上（n=50/56；E.faecium，E.faecalis，E.hirae克隆谱系）（表S9）。特别地，MerA或TcrB基因主要由质粒携带（分别为88%，75-270 kb；100%，70-270 kb），且它们通常位于同一质粒上。相比之下，ArsA_I和ArsA_II基因主要分布在染色体上（85%）。MerA_II、MerA_IV或MerA_V变体中均可检测到TcrB基因，而ArsA_I中较罕见。五种屎肠球菌存在多个MerA变体（MerA_II+MerA_IV或MerA_IV+MerA_V）。此外，来自不同物种或食用动物/食品相关环境的分离株中，MeT和ABR基因可能共存。最常见的ABR基因是ermB（n=20）、tetM（n=13）、tetL（n=11）和aadE（n=8），而aac(6′)-Ie-aph(2″)-Ia（n=4）或vanA（n=3）较罕见。仅含ABR基因的分离株在共存质粒（25-150 kb）或染色体上。以代表性屎肠球菌（n=8）和粪肠球菌（n=3）进行的接合转移（实验）分析，发现当使用含有抗生素（四环素、万古霉素或红霉素）或Cu的平板时，大多数情况下MeT质粒都能随tetM、tetL、ermB、aadE或vanA基因成功转移，结合转移率为10^-3-10^-5（表S9）。

此外，对肠球菌中As（ars）、Hg（mer）或Cu（tcrB）操纵子的遗传环境进行分析。基因组显示它们普遍有共同的遗传位点（图S2），并且还与其他与Cd（cad）、Cu（cop）或外排系统（重金属输出ATP酶）的MeT基因相关。这些遗传平台富含如下插入序列（如类IS3、IS4/IS5、IS6、IS30、IS66、IS110、IS256、IS200/605、IS982、ISL3、IS1182）、重组酶（主要是类酪氨酸、丝氨酸）、移动相关的蛋白质（如TraC、TraE、TraG、MobC、MobE、MobL）、增殖相关的蛋白质（如RepS、RepB）或稳定性相关的蛋白质（如RelB、RelE、ParA、ParR）。也包含编码ABR基因的序列，包括vanA、tetM、ermB、aac6'-Ie-aph2″-Ia、aadK或blaZ（图S2-A、D、E），以及编码Hg和As耐受基因的序列，如编码细菌素分泌和转运、菌毛蛋白和粘蛋白结合蛋白、糖代谢等相关的蛋白（图S2-D）。

6. MeT基因（As、Hg、Cu）与其表型相关

野生型肠球菌的金属（抗性基因）表型分析结果表明，携带MeT基因的菌株比未携带MeT基因的菌株表现出更高的MICs浓度（表S9）。大部分携带ArsA（82%-n=9/11）、MerA（90%-n=19/21）或TcrB（97%-n=32/33）基因的肠球菌Na₃AsO₄和CuSO₄的MICs≥16 mM、HgCl₂的MICs≥16 μM。所有不含ArsA（n=21）、MerA（n=15）或tcrB（n=5）的菌株均表现出较低的MICs浓度（Na₃AsO₄、CuSO₄和HgCl₂分别<8 mm、<16 mm和<16 μM）。因此，我们认为Na₃AsO₄的MIC≥8 mM、HgCl₂的MIC≥16μM、CuSO₄的MIC≥16 mM是金属耐受型菌株的标准。

As、Hg或Cu操纵子的突变（Na₃AsO₄的MIC=0.5-4 mM的ArsA_I或ArsA_II菌株，HgCl₂的MIC=8μM的MerA_IV菌株；CuSO₄的MIC=12 mM的TcrB菌株）会影响MeT的表型。由于我们获得了Na₃AsO₄的MIC=0.5 mM的阳性ArsA_II屎肠球菌的基因组，我们可以通过删除arsDRAIacr3Iacr3II操纵子、只保留arsdair基因簇来证明这种表型的存在（图S2-G：分离株SN71；GenBank GCA_006376285.1）。然而，当前缺乏验证本研究中金属浓度标准的参考数据库。

对几十年来包括肠球菌属在内的不同菌群的汞（MerA）和砷（ArsA）抗性遗传元件的多样性进行分析，结果表明，长期的金属污染会导致MeT基因的出现甚至延续。相比于ArsA和MerA蛋白，TcrB可能在细菌群落中处于较新的进化阶段，或者在其他变种中受到转移限制的青睐。在本研究中，TcrB和ArsA基因与动物/集约化食用动物生产环境和食品/食品加工环境有很大关联，表明Cu（如饲料添加剂）和As/Sb（如杀虫剂、动物传染病抑制剂）在食物链中具有特殊地位。然而，也不能排除对食物链有影响的其他环境污染源（例如受污染的水或土壤）。尽管如此，TcrB、ArsA和MerA基因还是在不同来自克隆谱系、地理区域和时间范围（120年）的肠球菌中检测到，反映了金属污染的普遍性。与MeT基因的流行病学背景无关，本研究菌株（野外分离株）中均可以观察到As、Hg或Cu的抗性表型，这表明所有研究的MeT基因在肠球菌中仍然具有功能（尽管其检出率低于25%）。然而，由于我们的野外分离株大多经过抗生素筛选获得，而且多数是根据其ABR或毒力特征进行测序的，而来自污染环境的MeT菌株可能对抗生素敏感或不携带毒力决定因素，因此所测基因组的偏差可能会影响MeT的检出率。

当环境或宿主受到胁迫（如金属、抗生素）后，为在有毒的环境条件下生存，基因、遗传模块组成、遗传平台或克隆多样性可能与随后细菌群落的扩增变化。本研究揭示了包括As和Hg操纵子在内的肠球菌在所有水平上的MeT基因型多样性。此外，不同细菌类群中存在多种ArsA/MerA变体，表明As和Hg操纵子的多样化可能与肠球菌偏好的特定生态环境有关。例如，具有冗余Ars基因的操纵子常存在于被As污染的环境中，且可能与不同环境条件（如温度、As浓度）下As抗性基因的表达有关。在人类和动物肠道中，金属胁迫情况可能不同，其不仅取决于宿主的金属摄入量，而且还取决于其他因素（如主饮食或当地微生物区系），这都会影响影响金属的生物利用率和基因组中的可用MeT遗传元件等。

此外，插入MeT操纵子的遗传平台的进化往往与水平基因转移和重组有关。在同一遗传背景下，As、Hg或Cu操纵子通常共存，表明肠球菌中特定的质粒或染色体区域是MeT基因积累的热区。重组热区可能与丝氨酸和酪氨酸重组酶的频繁出现有关。事实上，暴露于金属环境后，Curiavidus metallidurans和Pseudomonasputida中转座酶基因的表达增加。然而，不具有转位功能的MeT操纵子的研究结果表明，这些操纵子通过这些可移动元件在遗传平台内的重新排列而稳定或驯化。后者可能是通过毒素-抗毒素系统或者某些特定基因（如编码菌毛、细菌素生产、糖代谢、粘蛋白结合蛋白、分类酶的基因）在细胞中得以维持，从而在人类或动物等宿主中定植。在MeT和ABR基因的共生环境中，不同的金属与抗生素的协同抗菌作用可能有利于MeT和ABR基因的聚集及协同转移。

MeT质粒或特定染色体平台的稳定和长期维持可能会大大提高可用遗传模块的筛选效率，比如，与四环素类、大环内酯类或氨基糖苷类抗药性相关的基因广泛分布于不同生境的Firmicutes（拟杆菌）中。1900年到1959年的大多数菌株含有MeT基因，因此1960年后MeT肠球菌主要从已有的基因组中检出。1950年后到1960年代以来，MeT肠球菌获得ABR基因，这个时间与抗生素被引进医学以及在农业和畜牧业生产中的时间一致。1980年检测到编码万古霉素的抗性基因。尽管有报道称添加Cu的饲料对万古霉素抗性菌的影响并不显著，但有研究表明，该制剂禁用后，添加铜可以延缓万古霉素的降解。最近，与利奈唑胺抗性以及其他常用于食用动物的抗生素（如酚类、四环素）有关的基因poxtA和optrA也被发现，它们与MeT肠球菌的重组进一步提高了抗生素胁迫的食物链或环境中的细菌生存能力，也有利于抗生素和金属对利奈唑胺耐药性的持续选择。事实上，我们的数据显示，不同的MeT（如MerA, TcrB）和ABR（如vanA、tetM、ermB）基因共存于接合转移的质粒上，并且在不同的抗生素或金属的选择下可以产生新的MeT-ABR分离株（接合转移子）。

总之，本研究表明，肠球菌积累了来自同一个遗传交互群落的多种MeT操纵子，该群落包含厚壁菌及其它门的菌群，这反映了上世纪旧的（如重金属）和新的（如抗生素）主要人为污染物的更替。不同来源、不同时间跨度和不同克隆谱系中粪肠球菌和屎肠球菌的主要功能操纵子的分布、以及它们从交换遗传细菌群落中获取不同（抗性）基因的能力，使其有望成为未来识别和量化人类活动造成环境污染的生物指标的理想候选生物。它们的生长速度、对不同环境条件（如pH、温度、饥饿）的适应能力以及表达可用于监测有毒污染物（如Cd、Hg）的应激蛋白。然而，筛选MeT肠球菌所需的Hg、As、Cu最低浓度仍需进一步确定。金属参与全球生物地球化学循环（如空气、水、（食物链）营养级），并对细菌群落产生潜在影响，为实现“同一健康”计划目标，全世界仍需要努力减少Hg、As、Cu等金属对环境的影响。