【中西合璧】电针可通过外周膜联蛋白a1 -甲酰基肽受体2/ alx -阿片受体通路的前溶解机制减轻炎症性疼痛

背景：

前溶解机制是最近描述的控制炎症的内源性过程。本研究评价了这一机制的组成部分，包括annexin1(ANXA1)和甲酰肽受体2/ALX (FPR2/ALX)受体，在抗痛觉过敏效应的电针(EA)诱导的动物模型的持久性周围炎症信息。                  

材料和方法

动物类

所有的实验程序都是按照美国国家卫生研究院的动物护理指南(NIH出版物No.80-23)进行的.所有的实验都是使用雄性瑞士小鼠（25-35克）进行的，这些小鼠来自圣卡塔琳娜联邦大学(巴西佛罗里亚诺波利斯的UFSC，巴西圣卡塔琳娜)的病毒室。动物被安置在22±2℃，在12小时光照/12小时黑暗周期下（早上6点光照亮着），可以获得食物和水。所有实验测试均于上午11时至下午3时之间进行。动物的数量和使用的有毒刺激的强度是证明治疗一致效果的最小最低限度。实验是在协议批准后进行的(17.002.2.07.iv.)由南圣卡塔琳娜大学(UNISUL)伦理委员会撰写。

药品名称

实验使用了以下物质：CFA、格里斯试剂、苏胺酰胺和美国西格玛-奥德里奇的抗肌动蛋白抗体(HRP)；之间®，PMSF、EDTA、异丙氨酸A和苯氯化铵，圣迭戈，加州，美国）；那洛酮、BML-111和WRW4（2)来自托克里斯库克森公司（美国密苏里州埃利斯维尔）；来自圣克鲁斯生物技术(美国TX)的抗FPR2/ALX受体抗体；以及ShermoFisiher科学（美国威豪）的A1多克隆抗体。所有的药物在使用前都被溶解在生理盐水中。接收到的对照组动物的相同体积的生理学的生理盐水 已使用的至稀释这些化合物，并同时进行评估使用NKLEL608电刺激器（NKL电子产品，Brusque，SC）分散不对称平衡波（F1=2Hz，0.7ms脉冲，0s刺激；F2=10Hz，0.2ms脉冲）。先前的EA相关研究已经证实，2至10Hz的频率可有效抑制炎症和神经病性疼痛。为了阻止我们的CFA诱导的外周疼痛模型中最有效的EA治疗时间，用不同组动物测试了5min、10min和20min的电刺激。

为了确定电刺激是否必要，以及针头的位置是否与治疗结果相关，包括了两个不同的针刺对照组。在对照组1，进行活性EA组相同的相同程序，但没有电流进入穴位（即ST36和SP6）。其他组动物使用BML-111（0.3μg/100μl、1μg/100μl和3μg/100μl），并在与EA治疗动物相同的实验时间进行评估。研究相关作用机制的实验仅治疗其他动物（BML-111剂量为0.3μg/100μl和1μg/100μl）。

研究大纲

本研究的主要结果是冯弗雷试验评估的机械性过敏症。在炎症过程诱导24小时后，不同组的动物在不同时间（5min、10min和20min）接受EA或BML-111（0.3-3μg/100μl/s.c）的治疗。在不同的治疗时间或剂量下对动物进行评估，以确定产生最佳抗过敏效果的特定剂量(图1).在确定了最有效的EA治疗持续时间和BML-111剂量后，随后的实验使用了这些方法最佳的处理参数。在CFA结束后的第4天评估了水肿。此外，还进行了第二个实验，以确定每日EA或BML-111(即在CFA注射后的第一天和第五天)可能产生的总和效应。在表征了EA和BML-111的抗高汞效应后，下一步是分析阿片类受体对这种抗高汞效应的影响。为此目的，在CFAi.pl之后的第一天和第五天。注射后，预注射小鼠（i.pl.）。生理盐水或纳洛酮（个人）然后用BML-111或EA进行处理。30分钟后，机械性汞合金过敏被评估。同时也使用了各自的对照组。在CFAi.pl发生后的第一天和第五天，也研究了FPR2/ALX受体对EA和BML- 111抗高汞合金作用的影响。注入。在这些实验中，小鼠预先服用生理盐水或WRW4（i.pl）。然后用BML-111或EA进行处理。30分钟后，机械性汞合金过敏被评估。同时也使用了各自的对照组。最后，在CFA注射后的第二天测定了用BML-111治疗的动物EA或BML-111治疗的爪子组织中FPR2/ALX受体和AnxA1的表达。

机械性过敏过敏的评价

适应后，机械刺激退出阈值使用冯弗雷丝应用于后爪无毛皮肤，将小鼠放置在一个透明的有机玻璃框的高铁丝网平台上(9×7×11cm3). 的右侧 后 爪子是受刺激的 具有a常数受压力的a0.6g冯氏弗雷市灯丝(vff)（储存，芝加哥，美国）。的退出响应情况工作频率（表示的 如：10冯弗雷丝应用被解释为伤害感受刺激诱导你的行为。为了评估EA和BML-111对CFA诱导的持续炎症疼痛的影响，动物在CFAi.pl后的1天或5天使用EA或BML-111治疗注入。

对机械性汞痛过敏的发展进行了评价

治疗后0.5h、1h和2小时，以验证EA或BML-111减少机械性过敏的时间过程。为了研究重复治疗的影响，每天进行一次EA或BML-111治疗。连续5天在治疗后0.5小时（急性治疗中观察到的最大抑制时间）评估机械性过敏。

爪子水肿的评价

通过比较右后爪的厚度与基线测量值（在CFA注射前进行）之间的差异来确定CFA术后的水肿。使用数字微米（尺寸®，巴西SP）至获得后爪子的测量值变化量，和结果以百分比差异表示。在CFA注射后的第4天进行了评估，治疗后的0.5小时、1小时、2小时、3小时和24小时。

阿片类受体拮抗剂

为了评估外周阿片类药物受体对EA抗高汞合金作用的可能作用，给小鼠注射生理盐水（20μl/i.pl）。或纳洛酮（5μg/i.pl. ）生 理 盐 水 注 射 前 15min（10ml/kg，南卡；对照组）和20minEA（EA组）或 BML-111（0.3μg/100μl，南卡）。治疗后0.5小时评估机械性过敏。

FPR2/ALX拮抗剂的外围给药

在另一组旨在评估周围FPR2/ALX参与EA诱导的抗过敏症的实验中，动物接受了足底内注射(i.pl.)。右后爪内装有20μl的生理盐水或WRW4（10μg/爪）。15min 后，这些动物用 EA 治 疗 20min 或 BML-111（0.3μg/100μl，s.c.）。

评估机械过敏

斑迹：皮爪中ANXA1和FPR2/ALX受体的定量注射后第二天，每日治疗结束后0.5小时，采集右后爪组织样本（动物连续两天每天治疗一次）。将皮爪组织样本储存在冷冻室中（−80°C）。皮肤爪浸在液氮中，磨碎，并立即放入含有RIPA裂解缓冲液(1%无理想P-40,0.5%脱氧巧克力钠，0.1%SDS和PBS)和100mM正钒酸钠，100mMPMSF和1% 蛋白酶抑制剂鸡尾酒(SigmaAldrich，St。，然后在冰上孵育30min。含有溶液的管在10000rpm离心，4°C离心20min。收集上清液，用布拉德福德法测定蛋白质浓度。在10%十二酰磺胺聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)中使用60μg蛋白质，实现电泳分离® 四体单元格仪器下面 a PowerPac™HC电源（美国加州Bio-Rad）。这些蛋白质被转移到PVDF膜上（生物拉德实验室公司，美国加州赫拉克勒斯），被5%的BSA阻断(在TBS-T中制备缓冲区，pH7.4; 浓度浓度在 mmol/l：20铬三铁，137氯化钠，0.1% 中间20), 以及已孵育的过夜的在4含有FPR2/ALX受体原发抗体的°C（稀释1：500）和ANXA1（稀释1：1000）。过氧化物酶偶联抗β-肌动蛋白的单克隆抗体（稀释剂）（1.45万）用作所有测试样品的加载控制。初级抗体培养后，用TBS-T溶液洗涤膜三次（每次10min），并用与黄蛇过氧化物酶(HRP)结合的特定二次抗体在室温（1h）孵育。再次用TBS-T溶液洗涤滤膜三次（每次10min），并暴露于HRP基底物中（皮尔斯生物技术，罗克福德，罗克福德，美国）。使用ChemiDocMP系统（生物雷达实验室）通过化学发光可视化免疫复合物。使用制造商软件进行密度测量带（图像实验室；4.1版；美国加州赫拉克勒斯生物雷达实验室）。使用β-肌动蛋白的数据进行标准化，并表示为任意单位。在这些实验中，分析了以下各组（n=5-8）：生理盐水 、 CFA+ 生理盐水 、 CFA+EA20min 、 CFA+BML-111 （0.3μg/100μl，s.c.）、CFA+WRW4（10μg/i.pl。)，CFA+WRW4(10μg/i.pl.)+EA20min 和CFA+WRW4(10μg/i.pl.)+BML-111 (0.3 μg/100μl，s.c.).

统计学分析

使用图形板棱镜软件（6.0版；美国拉霍亚）进行分析。最初应用夏皮罗-威尔克正态性检验来评估数据的正态性。结果表示为连续变量的平均±标准差(SD)。数据采用方差(anova)单向分析、学生纽曼-库尔斯事后测试或双向分析，随后采用邦费罗尼事后测试进行分析。

测试结果

EA和BML-111可减少机械性过敏症

研究结果如图所示。2a证明在第一天发布CFAi.pl。注射时，EA对20min的急性治疗可显著降低机械过敏0.5h （P<.001）和1h（P<.001），最大抑制作用(MI)为64.0±5%，治疗后0.5h。10min治疗35.0±10%即可降低机械过敏(图。2a)。另一方面，5min的艺电并不影响爪退出频率。2a)。除此之外，连续5天每天进行20min治疗可 减少 所 有评 价（ P<0.001） 机械过敏（图2b)。图2c显示了在CFAi.pl后的第五天。注射，20min治疗可显著减少机械过敏至2小时，治疗后1小时为65.0±13%。

研究结果如图所示。在第一天发布CFAi.pl。注射，BML-111(0.3-3μg/100μl)，经皮下注射，在0.3μg/100μl，30min中为59.0±8%。在第1 天（P<0.001）和第3天（P<0.05）内，每天使用BML111（ 0.3μg/100μl ）降低 爪 取 出频率（ 图.2e)。图2f显示，在CFAi.pl发布后的第五天。注射，仅BML-111（0.3μg/100μl）显著降低机械过敏，MI为34.0±11%，治疗后的0.5h。EA和BML-111并没有改变爪子水肿连续4天每日治疗EA或BML-111 （ 0.3μg/100μl，s.c.）均不能减少爪子水肿（P>0.05）。

外周阿片类受体介导EA和BML-111的抗高痛作用

在图中3a，双向分析显示了纳洛酮预处理（ F （1,21）=8.519、P=.0082）和纳洛酮预处理×BML- 111的相互作用（F（1,21）=4.982；P=0.0366），但不是BML-111（F（1,21）=2.948；P=。1007）的主要影响。事后分析表明，用BML-111治疗小鼠减少了机械性过敏(P=。0424)，用纳洛酮预处理预防了(P=0.0314)由BML-111引起的抗高过敏作用。此外，双向anova显示了纳洛酮预处理（F（1,26）=5.501,P=0.0269）和EA20min（F（1,26）=5.905；P=0.0223）的显著主要影响，但是非那洛酮预处理的×EA20-min相互作用（F（1,26）=4.201；P=0.0506）。事后分析表明，用纳洛酮预处理小鼠可预防（P=0.0345）由EA20min引起的抗高汞合金效应。

 此外，双向anova显示了纳洛酮预处理（F（1,25）=5.324、P=0.0296）和EA20min（F（1,25）=7.445；P=0.0115）和纳洛酮预处理×EA20-min相互作用（ F（ 1,25）=7.161；P=0.0130）。事后分析表明，纳洛酮小鼠预处理可预防（P=0.0154）EA20min引起的抗高汞合金效应（图3d)。 

外周FPR2/ALX受体参与EA和BML-111的抗高过敏作用

研究结果如图所示。4a和b在CFA之后的第一天证明。双向注射显示BML-111 治疗（ F（1,23 ）=16.97；P=0.00004）和WRW4（10μg/i.pl）的显著主要作用。预处理×BML111 相互作用(F（1,23 ）=10.48 ；P=0.0036) ， 但不是WRW4的主要影响(10μg/i.pl.)。预处理（F（1,23）=4.243；P=0.0509）。事后分析表明,WRW4对小鼠预处理（10μg/i.pl）。防止了由BML-111引起的抗高汞合金效应(P=0.0045，图4a)。在图中4b，双向分析显示了WRW4的显著主要影响(10μg/i.pl)。预处理（F（1,24）=6.584；P=0.0170）和EA20min（F（1,24）=8.766；P=0.0068)，和一个WRW4 (10 μg/i.pl.)。预处理×EA20-min相互作用 （ F （ 1,24）=6.584;P= 0.0170）。事后分析表明，小鼠的预处理与WRW4 (10 μg/i.pl.)防止由EA20min引起的抗高汞合金作用（P=。0068）。

研究结果如图所示。4c和d在CFA注册注册后的第5天证明.双向注射显示 了 WRW4 的显著主要影响(10μg/i.pl)。预处理（F（1、23）=6.169；P=0.0207）和BML-111（F（1、23）=7.599；P=0.0112)，和一个WRW4 (10 μg/i.pl.)。预处理 ×BML111相互作用 （ F （ 1 、 23 ） =7.599 ；P=0.0112 ）.事后分 析表明 ， WRW4 对小鼠预处理（10μg/i.pl）。防止了由BML-111引起的抗高汞合金效应(P=0.0050，图4c)。在图中4d，双向分析显示了WRW4的显著主要影响(10μg/i.pl)。预处理（F（1、23）=8.946；P=0.0065）和EA20min（F（1、23）=11.65;P=0.0024)，和一个WRW4 (10 μg/i.pl.)。预处理×EA20-min 相互作用（F（ 1 , 23 ）=11.65 ；P= 0.0024 ）.事后分析表明,WRW4 对 小 鼠 预处理（10μg/i.pl）。防止由EA20min引起的抗高汞合金作用（P=0.0010）。 

EA治疗增加ANXA1，增加爪子FPR2/ALX受体的表达

在图中5a,单向分析显示治疗的显著主要作用（柱间）（F（4、27）=5.806；P=0.0017)。结果表明，动物注射了i.pl。生理盐水在爪皮中组成性表达ANXA1，Tukey的事后多次比较试验表明，在CFAi.pl后2天后。注射时，该蛋白的水平会下降（P<。05）。这种减少可以证明在注射的组（例如）仅用WRW4治疗的CFA(P=0.0399)。与用生理盐水治疗CFA的动物相比，仅用生理盐水EA治疗的动物组的ANXA1的值更高（P=0.0474）。然而，与用EA治疗20min的动物相比，用WRW4扩张和用EA治疗20min的动物在后爪皮肤中ANXA1的表达水平较低(P=0.0119)较低。在图中。5b、单向分析显示了治疗的显著主要效果（柱间）（F（4、32）=7.420；P=0.0002）。Tukey的事后多次比较测试表明，注射的动物组（i.pl.）。用WRWA4（P=0.0002）或WRW4+BML-111（P=0.0015）治疗，但不是用注射CFA和生理盐水（P=0.1611）或BML-111（P=0.0803）治疗的动物，ANXA1的表达值较低。在图中6a单向分析显示了治疗的显著主要效果（柱间）（F（4、34）=5.302；P=0.0020）。Tukey的事后多次比较测试表明，注射的动物组（i.pl.）。生理盐水组成性表达爪子中的FPR2/ALX受体，在CFAi.pl2天后。注射时，该受体的表达有增加（P<0.05）。这一增加在接受CFa治疗的各组中也得到了证明。注射液，仅用生理盐水（P=0.0362）或EA治疗20min（P=0.0025）。接受了二战第4次治疗的动物与仅接受20min治疗的动物相比，接受20min治疗的爪子中FPR2/ALX受体的表达水平较低(P=0.0307)。在图中。6b、单向分析显示了治疗的显著主要效果（柱间）（F（4、35）=4.432；P=0.0053）。Tukey的事后多次比较测试表明，注射的动物组（i.pl.）使用CFA和生理盐水治疗（P=0.0315）和BML-111（P=0.0048），FPR2/ALX受体表达的值较低。此外，与仅用BML-111治疗的组相比，预用WRW4治疗和用BML-111治疗的动物组FPR2/ALX受体表达值降低（P=0.4690）（尽管结果无统计学意义）。

 讨论

本研究的主要结果如下：(i)EA降低CFA诱导炎症（早期和晚期），FPR2/ALX拮抗剂降低EA作用，(ii)外周阿片受体拮抗阻止EA治疗和全身注射FPR2/ALX激动剂引起的抗痛作用，(iii)EA增加发炎爪子的ANXA1水平。

使用药理学方法，通过LXA激活FPR2/ALX受体4或者ANXA1已经被证明了至生产抗炎性的以及抗过敏症作用，包括抑制白细胞粘附到血管壁，诱导组织中性粒细胞凋亡，正在激活的单核细胞至执行操作渗作用,抑制作用的促炎性的细胞因子释放,以及中性粒细胞诱导阿片类药物释放等作用。

考虑到非药物治疗方式的潜在机制，已证明EA生产在至少是一些的， 如上文所述效果.然而，参与的fpr2/alx 受体在抗过敏症效果的电子a 是：未知的信息。因此，在的本研究表明，的效果的电子a 在早期以及延迟相位的炎症性的疼痛感诱导. 如井油注入在小鼠注射引起持续炎症性疼痛。单一的EA治疗在炎症早期产生短暂和时间依赖的抗高痛作用。EA每日治疗继续诱导抗过敏过敏症。在炎症的晚期，EA比早期有更明显的持久镇痛作用。本研究结果证明ST36和SP6穴位的低强度节段EA可以减少小鼠CFA注射诱导的机械过敏，证实并扩展了目前的文献数据。与研究结果相关的是，黄和同事表明，低频EA(2Hz)仅在ST36穴位20min，在CFA或卡拉胶注射后立即进行，可减少大鼠的机械和热过敏（热和冷）。陈先生及其同事们在CFA或卡拉胶诱导的爪子炎症小鼠中，在注射第1、2、4、7天后，EA只有用低频(2Hz)治疗20min后才能减少机械性过敏。最后，廖和同事表明，在服用CFAmini.pl的小鼠中，ST36和SP6穴位的EA连续3天减少了机械性痛觉过敏。注入。虽然EA的镇痛作用在文献中已经确立，但本研究增加了重要的新信息，详细说明了在CFA诱导炎症的早期和晚期不同刺激 持续时间进行的EA抗高痛反应的时间过程。FPR2/ALX受体的抗炎作用是众所周知的。

我们还检查了系统注射的BML-111在CFAi.pl引起的炎症性疼痛的早期和晚期的影响。注射给小鼠体内。BML-111已减少连续5天的机械性过敏过敏，表明FPR2/ALX是CFA诱导的炎症疼痛的重要组成部分。因此，下一个逻辑步骤是检查FPR2/ALX封锁对E诱导抗过敏的影响。事实上，FPR2/ALX与WRW4的拮抗作用对BML-111在CFA诱导炎症的早期（第一天）和晚期(111和EA都有影响。这些结果可能与评价期间的优势细胞的数量有关。FPR2/ALX在中性粒细胞和单粒细胞等免疫细胞中表达。在先前的研究中，中性粒细胞被证明是早期炎症（注射后24小时内）中含有白细胞种群的主要阿片类肽，而单核细胞/巨噬细胞在晚期占主导地位。迄今为止，ANXA1-FPR途径已被证明诱导炎症疼痛的阿片类强子释放。

据报道，阿片类药物和血清素受体都参与了电刺激引起的抗感受作用。低频EA诱导内啡肽和头啡肽的释放，导致发病速度较慢和持续时间较长的镇痛作用，可被诺洛酮逆转。然而，EA如何诱导内源性阿片类药物的释放尚未完全阐明。假设EA的抗高汞作用可能是由于炎症期间免疫细胞释放的内源性阿片，我们局部给予非选择性阿片受体拮抗剂（纳洛酮），我们的数据表明，在CFA诱导炎症的早期和晚期预防了EA或BML111抗高汞作用。数据表明，EA诱导的ANXA1的释放激活FPR2/ALX受体，因为ANXA1可以诱导中性粒细胞的阿片类释放。阿片类药物的释放可以诱导 CFA诱导的炎症的镇痛，这取决于细胞内钙2+的动员和 磷脂酰肌醇酶的激活 3-激酶， 两者的哪个是已知的至是ANXA1和FPR2/ALX受体的细胞内信号。这些效应是由μ和δ介导的阿片类药物受体，和当 fpr2/alx拮抗剂，这个镇痛作用可以被阻断。

在我们对EA和外周阿片类受体的初步结果之后，下一个主要步骤是研究在CFA诱导炎症的早期和后期外周FPR2/ALX受体参与EA抗高汞的作用。本研究结果表明，外周FPR2/ALX受体特异性拮抗剂预防相同剂量的抗高汞作用，防止BML-111的抗高汞活性。本研究表明，FPR2/ALX受体在皮肤爪中具有成分表达，CFA增加了其表达。由于CFA在油性溶液中含有热灭活分枝杆菌，含脂多糖(LPS)由于存在，LPS可以增加微胶质细胞和微血管内皮细胞中FPR2/ALX的表达。有趣的是，用WRW4预处理和用EA或BML-111治疗的动物群在爪子中的FPR2/ALX受体表达较低。综上所述，外周FPR2/ALX受体的药理阻断和蛋白质水平的结果表明，该受体在EA和BML-111的抗高汞合金作用中发挥了作用。

据我们所知，FPR2/ALX受体在伤害性感受性主要传入物的外周端的表达尚未被证实。然而，我们已知，外周免疫细胞和支持性细胞可以影响神经元的活动（痛觉）。例如，在受伤的皮肤中，由非神经元细胞（即成纤维细胞、角质形成细胞以及浸润性免疫细胞）表达和/或分泌的因子可以调节痛觉感受器的敏感性，从而影响亲痛觉或镇痛的疼痛感觉。尽管免疫细胞在抗接种中的作用已经充分确定，但角质形成细胞和成纤维细胞表达阿片类药物在周围镇痛中的确切贡献却知之甚少。由于FPRs已经被报道参与了角质形成细胞的激活，需要进一步研究探索这两种细胞类型的贡献（例如，建立一个共同培养的中性粒细胞和角质形成细胞的系统）。我们的研究结果显示，在CFA治疗后，后爪皮肤中的ANXA1水平有所下降，而EA治疗可以防止这种下降。此外，还有i.pl。WRW4预处理防止EA诱导爪子ANXA1水平的增加。因此，我们的研究提供了直接证据，证明FPR2/ALX介导ANXA1对炎症疼痛的抗高痛影响，并推断ANXA1水平的增加可能是中性粒细胞(CFA后2天)合成和释放的结果。裴和他的同事表明，高剂量的ANXA1肽和BML-111并没有增加，但实际上，ANXA1的表达略有下降。该数据表明，随着AnXA表达后ANXA1表达的增加12–26（ANXA1衍生的 肽类） 以及 bml-111 行政管理，该表达式 的 fpr2/alx 可能会出现变更。

综上所述，我们目前工作的主要贡献是首次证明， EA或使用LXA4(BML-111) 类似物可以减少机械性过敏，但在CFA诱导的炎症性疼痛模型中不是水肿。这种效应至少在一定程度上是通ANXA1/FPR2/ALX通路和与阿片类药物系统的串扰。