编译：微科盟Erics，编辑：微科盟木木夕、江舜尧。
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导读
环境中积累的塑料，特别是微塑料（小于5毫米的颗粒），可能会导致一系列问题并对生态系统造成潜在危害。聚羟基烷酸脂（PHAs）是一种可降解塑料，用于地膜和包装材料，以减少塑料垃圾和土壤污染。然而，微生物塑料对土壤-植物相互作用的影响，尤其是对农业生态系统中土壤微生物群落结构和功能的影响，目前尚不清楚。本研究首次将酶谱法（定位酶活性热点区）与底物诱导的生长呼吸相结合，探讨常见的新型生物高分子poly（3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate，PHBV）的添加对土壤微塑料际（即土壤和塑料微粒颗粒之间的界面）中微生物群落结构、生长以及酶动力学的影响，并将其与根际和非根际土壤作比较。研究发现，植物根际土壤微生物群落极易将PHBV作为碳源，从而提高特定微生物的生长速率，使微塑料际中的微生物生物量比在非根际土壤中更为活跃。与根际相比，微塑料际中β-葡萄糖苷酶和亮氨酸氨基肽酶的活性较高（Vmax高0.6-5.0倍），酶亲和力较低（Km高1.5-2.0倍）。与未处理土壤相比，PHBV的添加改变了不同分类学水平上的土壤细菌群落，增加了α多样性，以及酸杆菌门（Acidobacteria）和疣微菌门（Verrucomicrobia）的相对丰度。总体而言，PHBV的添加产生了土壤热点，通过增加微生物生物量和活性，使土壤C和养分的转化率大大增强。综上所述，微生物塑料具有改变土壤生态功能和生物地球化学循环（如SOM分解）的潜力。
原名：The microplastisphere：Biodegradable microplastics addition alters soil microbial community structure and function
译名：可生物降解微塑料的添加改变了土壤微生物群落结构和功能
期刊：Soil Biology & Biochemistry
IF：5.795
发表时间：2021.03.11
通讯作者：臧华栋
通讯作者单位：中国农业大学农学院
不添加微塑料的情况下，平均植物生物量为0.24 g pot-1（表1）。然而，添加PHBV最终会导致植物在25天后死亡。PHBV的添加大大增加了土壤微生物的生物量和溶解性有机碳含量（p < 0.05，表1）。PHBV处理组中，MBC和DOC的含量分别比对照土壤高12倍和54倍。此外，PHBV处理组中MBN比对照组高出45%，而DON与对照组土壤相比降低了66%。表1.
未经任何处理（对照组）与
PHBV处理的土壤中的环境因子，包括植物生物量，微生物生物量碳（MBC）和微生物生物量氮（MBN）以及溶解性有机碳（DOC）和溶解性有机氮（DON），取四次重复的平均值（±SE），字母表示不同处理组间的显著性差异（p < 0.05）。通过底物诱导的生长呼吸计算得到MBC（根据等式（2）），通过氯仿熏蒸提取来测定MBN，通过非熏蒸提取测定DOC和DON。
微塑料际中β-葡萄糖苷酶和亮氨酸氨基肽酶的活性（Vmax）分别是根际中的0.6倍和5倍（p < 0.05，图2a和b）。同样，微塑料际中β-葡萄糖苷酶和亮氨酸氨基肽酶的底物亲和力（Km）是根际的1.5-2倍（p < 0.05，图2b和d）。与PHBV处理的非根际土壤中的β-葡糖苷酶和亮氨酸氨基肽酶的Vmax和Km值相比，微塑料际中β-葡萄糖苷酶和亮氨酸氨基肽酶的Vmax和Km值明显较高（p < 0.05，图2）。然而，在非根际土壤中，PHBV的添加并不会影响所测试的酶（p > 0.05，图2）。此外，β-葡萄糖苷酶的Vmax值与活跃微生物生物量呈正相关（R2 = 0.7，p < 0.05，图S4）。微塑料际中亮氨酸氨基肽酶的催化效率（Vmax / Km）高于根际（p < 0.05，图S2c），并且微塑料际中的周转时间比根际土壤中的周转时间缩短约5倍（图S2d）。然而，在PHBV处理组和对照组的非根际土壤中，所有酶的催化效率和周转时间均未发生改变（p > 0.05，图S2）。此外，相较于其他土壤样品，微塑料际中的向量角最小（p < 0.05，图S7d），表明微生物的代谢可能受到N的限制。
图2. 未经任何处理（对照组）与PHBV处理的土壤中，β-葡萄糖苷酶（BG），亮氨酸氨基肽酶（LAP）和酸性磷酸酶（ACP）的非根际和热点区潜在的酶活性（Vmax）和底物亲和力（Km），取四次重复的平均值（±SE）；字母表示不同处理组间的显著性差异（p < 0.05）。
在热点区（微塑料际和根际）以及添加和不添加PHBV的非根际土壤中，我们观察到不同的微生物生长模式对基质添加的响应（图S3）。微塑料际的基础呼吸（BR，45 μg C g-1 h-1）和底物诱导的生长呼吸（SIGR，58 μg C g-1 h-1）分别是根际土壤的10倍和12倍（图3a和b）。然而，与对照组相比，非根际土壤中的BR和SIGR不受PHBV添加的影响。在热点区和非根际土壤中，土壤呼吸均表现出对PHBV添加的明显响应（图S3）。与非根际土壤相比，PHBV的添加使微塑料际中的微生物最大比生长速率（μ）降低了22%（p < 0.05；图3c），而微塑料际和PHBV处理的非根际土壤中，μ没有明显差异（p > 0.05）。尽管微塑料际中比生长速率较小，但与根际土壤相比，活跃微生物生物量的比例增加了6倍，且滞后时间缩短了4倍（图3d，e，f）。
图3. 未经任何处理（对照组）与PHBV处理的土壤热点区和非根际，基础呼吸（BR），底物诱导的生长呼吸（SIGR），比生长率（μ），总微生物生物量（TMB），增长的微生物生物量占总微生物生物量的比例（GMB / TMB）及其滞后时间，取四次重复的平均值（±SE）；字母表示不同处理组间的显著性差异（p < 0.05）。放线菌门（Actinobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、绿弯菌门（Chloroflexi）、奇古菌门（Thaumarchaeota）和芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）是所有处理组土壤中的优势菌门，且涵盖了96%-98%的细菌片段。尽管在所有土壤中优势菌均一致，但整个处理过程中均观察到优势菌门的相对丰度发生了变化。与对照组相比，添加PHBV的土壤中的变形菌门（Proteobacteria）和酸杆菌门（Acidobacteria）的相对丰度较高，而厚壁菌门（Firmicutes）的相对丰度较低（p < 0.05，图4A）。在科水平上，添加PHBV后，20个相对丰度最高的优势科的比例下降了（图4B）。PHBV的添加引起动球菌科（Planococcaceae）、黄单胞菌科（Xanthomonadaceae），芽孢杆菌科（Bacillaceae）的减少和噬几丁质菌科（Chitinophagaceae）、丛毛单胞菌科（Comamonadaceae）和草杆菌科（Oxalobacteraceae）的增加（图4B）。图5C给出了由PHBV添加引起的非根际和热点区土壤细菌群落在科水平上详细的变化情况。所有样本共检测到3800个OTUs，对照组非根际土、PHBV处理组的非根际土和PHBV处理组的热点区土壤所共有的OTUs为3622个，而PHBV处理组的热点区土壤独有的OTUs为54个，PHBV处理组的非根际土壤独有的OTUs为16个（图5A）。与对照组土壤相比，PHBV处理的非根际土壤中ACE，Chao1，丰富度和Shannon指数的平均值分别增加了10%，11%，16%和18%（图S5）。然而添加PHBV后，微塑料际和非根际土壤的多样性指数没有差异（p > 0.05）。
图4. 未经任何处理的土壤（对照组-非根际），PHBV处理的热点区土壤（PHBV-热点区）和非根际土壤（PHBV-非根际）中平均相对丰度最大的10种细菌（门水平）的堆积柱状图（A）；在三种土壤样品中平均相对丰度最大的20个科的堆积条形图（B）。
图
5. 韦恩图展示了未经任何处理的土壤（对照组-非根际），PHBV处理的热点区土壤（PHBV-热点区）和非根际土壤（PHBV-非根际）共有的OTUs（A）；放大的热图给出了每个节点的分类学信息（B）；热图给出了不同处理组科水平的细菌群落，从中心到外部的每个节点代表不同的分类学等级（C），图形的权重和颜色由丰度信息确定。完整的PHBV及其分解产物具有非常低的细胞毒性。然而，所有PHBV处理组的植物最终在4周后死亡，这与以前的研究是一致的，后者表明传统生物基微塑料大量存在时，其降解产物可能对植物生长产生负面影响。鉴于生物塑料聚合体仅由C，O和H组成，PHBV可能会诱导土壤中必需的营养元素（例如N，P）的微生物固定化，导致植物胁迫增加。与对照组相比，添加PHBV的土壤中DON减少而MBN的增加进一步证实了这种N的固定（表1）。这与Sander（2019）的研究结果一致，他发现微塑料表面的微生物需要从周围土壤中获取N来促进其生长。这也表明PHBV可能刺激了机会性植物病原体，但是，需要更多的工作来证实这一点。另一种解释可能是由于PHBV降解过程中释放出大量的3-羟基丁酸，造成土壤酸化而引起植物中毒。但是，这通常会影响根的生长，而不是芽的生长。此外，对于其他生物聚合物（例如纤维素，蛋白质）的降解，由于微生物的快速消耗，不太可能发生单体的积累。这可能是因为它是天然存在的微生物存储化合物单体，但是，未发现的添加剂或聚合物中的污染物也可能引起植物毒性。最后，我们不能忽略PHBV加入后引起的土壤性质和微生物群落的变化，这些变化也可能抑制植物的生长，导致植物死亡。因此，我们得出与预期相反的结论，即：在短期内，PHBV含量较高的情况下，商业来源的PHBV对植物生长有害，正如7天发芽期间较低的种子发芽率所展示的那样（图S6）。因此，需要进一步的实验来确定该响应的机理。土壤酶的产生对能量和养分的利用率十分敏感，我们的研究支持了这一观点。其中生物可利用的C（即PHBV的降解产物）的输入使热点区中的酶活性比非根际土壤增加了2倍。鉴于聚-3-羟基丁酸酯是由广泛的不同类别的微生物（特别是在氮缺乏和冷胁迫的情况下）产生的常见的存储化合物，其对微生物活性的提高不足为奇。因此，利用PHBV-C的能力有望成为微生物群落中的一项广泛的特征。在添加PHBV的情况下，C和N的降解酶在热点区和非根际土壤之间的活性差异为2-10倍（图2a，c），这表明生物塑料掺入土壤会直接影响C和N循环。与根际土壤相比，微塑料际中β-葡萄糖苷酶的Vmax较高，这可能归因于添加PHBV后生物量的快速增长（图3e）。活跃微生物生物量的测量值与β-葡萄糖苷酶的Vmax之间呈正相关关系（R2 = 0.7，图S4），进一步证明了这一推测。β-葡萄糖苷酶的增加也表明PHBV刺激了其他常见的土壤聚合物（如纤维素）的分解。此外，PHBV可以被解聚酶分解而释放出羟基丁酸单体，从而促进胞外酶的产生（如亮氨酸氨基肽酶；图2c），进而分解SOM以获得生长所需的N。相对于非根际土壤，微塑料际的BR和SIGR较高，且PHBV处理过的土壤中DOC和DON的比例高于对照组土壤（图3a和b），这也支持了上述的推论。与此相一致，与根际土壤相比，微塑料际中观察到底物的周转时间较短，且亮氨酸氨基肽酶的Ka值较高（图S2c和d），这表明在微塑料际中群落受N的限制比P的限制更大。此外，与根际土壤相比，微塑料际中C和N循环相关的酶的比例活性较低，但C和P循环相关的酶的比例活性较高，这可以证明上述的结论。微塑料际中较低的向量角进一步证实了微生物的代谢可能受到土壤氮的限制。因此，我们推测由于氮的限制，微生物群落要么（i）改变了其水解酶的内在特性以适应富C生物塑料的存在；或者（ii）PHBV诱导了土壤微生物群落的变化，从而产生了不同类型的酶。总的来说，我们得出的结论是，PHBV供应的C刺激了微生物的生长，因此氮限制与微生物的氮固定化有关。PHBV分解代谢产生的C的输入将增加微生物生物量并增强N限制。MBC和酶活性（特别是与N相关）的增加，以及酶化学计量比和细菌群落的变化都支持了这一点。这与根际中的C热点区形成对比，在C热点区中，C的供应可能较少，并且根表皮细胞中的N也以氨基酸的形式流失，从而为微生物群落提供了更加均衡的营养供应。我们推测，聚羟基丁酸解聚酶的可用性会限制PHBV的初始分解。该酶在土壤中的丰度和表达水平仍然未知，但是，NCBI搜索显示其存在于多种微生物类群中。尽管PHB解聚酶可能是内部靶向的（即降解内部存储的C），但也有证据表明它可以是外部靶向（即一种胞外酶），可能降解死亡的微生物。我们的数据支持以下的观点：在外源供应的情况下，PHBV可以作为细菌群落唯一的C底物。但是，我们也观察到，与根际相比，微塑料际中微生物比生长率μ显着降低（22％），这表明了K策略微生物的潜在优势。K策略微生物通常将更多的C存储在其细胞中，且消耗较慢，从而降低其呼吸频率。因此，我们假设PHBV降解物将外源PHBV分解为单体，然后将其转运到细胞中，再发生PHB的聚合反应。较高的β-葡糖苷酶和亮氨酸氨基肽酶的Km值表明，微塑料际中的微生物群落结构会向与寡糖和肽较低亲和力的物种转移。酸杆菌门（Acidobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、和绿弯菌门（Chloroflexi）相对丰度的增加以及厚壁菌门（Firmicutes）相对丰度的减少与PHBV的添加有关，而以往研究中后者被描述为高C环境中生长旺盛的速生菌。相比之下，酸杆菌门（Acidobacteria）和绿弯菌门（Chloroflexi）往往在氮素利用率较低的贫营养环境中占主导地位。如上所述，PHBV降解过程中释放的大量的3-羟基丁酸也可能降低土壤pH值，这有利于酸杆菌门（Acidobacteria）的生长。硝化螺旋菌门（Nitrospirae）属于亚硝酸盐氧化细菌，在陆地环境中普遍存在，并且在农业土壤的生物氮循环和硝化作用中发挥重要作用。添加PHBV后硝化螺旋菌门（Nitrospirae）的较高丰度表明N循环发生了变化，这归因于微塑料际中的养分限制大于非根际土壤中的养分限制（如C和N循环相关酶的Vmax比值所示）（表S1）。在PHBV处理组中，拟杆菌门（Bacteroidetes）的相对比例也开始上升。这些广泛分布在土壤中的微生物，主要用于降解土壤中复杂的有机质。因此，与非根际土壤相比，PHBV处理过的土壤DOM的含量明显上升，这是由于PHBV降解过程中单体化合物的释放（表1）。尽管在这项研究中仅调查了细菌群落，但真菌和中型动物种群也可能受到PHBV添加的影响，并参与其降解过程。进一步的研究了解微生物群体之间复杂的相互作用是十分有必要的。总的来说，我们的结果突出了PHBV引发土壤微生物代谢变化的可能性（图6），从而潜在地影响微生物在土壤中的功能性作用。除微塑料际外，PHBV的添加还改变了非根际土壤中的微生物群落，表明这些变化不仅局限于土壤的热点区。
图6. 概念图展示了PHBV处理的土壤热点区微生物活性和功能的变化，垂直和水平红色箭头分别表示与非根际土壤相比，热点区微生物胞外酶动力学和功能的增加或没有变化。红色和橙色的渐变分别指示微塑料际和根际之间酶活性（Vmax）和底物亲和力（Km）的下降趋势，蓝色渐变表明微生物比生长速率（μ）呈增加趋势。农业土壤中的微生物活动通常受到C的限制，因此即使少量的碳输入也会诱导土壤微生物群落代谢能力的变化。我们研究结果清楚地表明，PHBV的添加可以增加微生物活性，促进其生长以及胞外酶的活性。这可能导致在共代谢作用下，天然土壤有机质矿化作用的提高，如微生物通过使用可降解的聚合物作为能源来降解土壤有机质。值得注意的是，与根际土壤相比，在微塑料际中发现了较高的酶活性和微生物生物量，以及较低的底物的亲和力，表明在热点区添加PHBV可以更好，更快地吸收碳和养分。总之，与根际环境相比，PHBV处理过的土壤的独特的环境可能有益于微生物存活，并改变土壤的生态功能和生物地球化学过程，从而刺激土壤C和养分循环。尽管已经将生物塑料作为石油基塑料的替代方案，但我们的研究表明，对生物塑料的潜在危害（例如对植物生长和健康）的进一步研究是非常必要的。化妆品中的塑料和农业中使用的农用覆盖膜就体现了这一点，其对环境负面影响仅在引入后数十年就开始出现。我们的研究旨在了解土壤中局部PHBV热点区的短期影响，而长期的现场研究是十分必要的。因此，需要在不同情况下（例如土壤类型，农业实践，气候变化）对PHBV进行生物降解的现场实验。此外，需要在更长的时间内使用实际的聚合物混合物进行实验，尤其要关注植物-土壤-微生物之间的相互作用。
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