单细胞测序or单细胞核测序如何选择

生物体正常的生理功能依赖于复杂的细胞及分子通过复杂的网络相互作用推进和完成，生物体的复杂程度在细胞类型、细胞比例、细胞的空间位置、细胞的基因表达、细胞间的通讯互作、染色质的状态、基因的序列等众多维度实现精准调控。单细胞测序作为新出现的强有力工具，正是解析细胞网络的合适技术手段，它通过一次性对数以万计的细胞进行检测，绘制出组织或器官的细胞图谱，明确细胞间的调控模式和状态变化，为解析生命机制提供细胞层次分辨率的系统见解。随着对科学研究的不断深入，单细胞测序（ScRNA-seq）的帝国包含了单细胞转录组测序，空间转录组测序、单细胞ATAC测序和单细胞免疫组等几个重量级产品，在不同水平揭示了组织内部的异质性。近期，有越来越多的研究者关注了单细胞核测序（SnRNA-seq）。相较于ScRNA-seq的针对单个细胞进行测序，SnRNA-seq制备单细胞核悬液，针对单个细胞核进行测序和分析。今天，小编为大家详细比较以下两者的优劣势，看看两者更适用于怎样的研究场景。

ScRNA-seq的局限

1、 仅适用于新鲜组织样本 

影响ScRNA-seq结果的关键因素是单细胞悬液的质量，ScRNA-seq对细胞悬液的质量要求非常高（细胞数量、活性、浓度、背景干扰等），因此细胞悬液的制备只适用于新鲜组织或者冻存后复苏组织（主要是前者），这限制了ScRNA-seq的应用范围，意味着保存在超低温冰箱中、具有重要科研和临床价值的大量珍贵样本无法进行scRNA测序。

2、解离导致某些细胞类型的丢失 

众所周知，解离过程中不同类型细胞在解离效率上存在差异，与免疫细胞相比，成纤维细胞和内皮细胞更多嵌于细胞外基质和基底膜中，因此更难以分解【2】；同时一些较为敏感的细胞可能会因为解离过度而破碎，因此解离过程大概率无法有效的获取到组织中的所有细胞类型，导致结果的准确性大为降低。

3、不适用于含大细胞的样本类型 

部分样本类型，例如心脏、肌肉、脂肪组织含有直径较大的心肌细胞、骨骼肌细胞和成熟的脂肪细胞，这些细胞的共同点均是“大”，例如心脏中大的心肌细胞，长和宽分别能达到100μm/25μm，而目前商业化的单细胞平台对细胞大小均有限制，以10X Genomics平台为例，其芯片中微管道直径为50μm，建议捕获的细胞不要超过40μm，因此上机捕获前需要经过30-40μm细胞筛过滤去除大细胞。如果研究的样本类型为心脏、脂肪等且关注心肌细胞、脂肪细胞信息，ScRNA-seq就不再是一个合适的选择。

基于以上列出的ScRNA-seq的局限性，SnRNA-seq开始在一些研究中被广泛应用，以脑组织单细胞转录组研究为例，目前大多数文章更倾向于实用SnRNA-seq，包括神经细胞【3-5】、心脏【6、7】、肾脏【8、9】、肝脏【10、11】、脂肪【12、13】等。

SnRNA-seq的优势

已经有大量文献证明，SnRNA-seq能够解决ScRNA-seq中存在的主要问题，其优势主要体现如下：

1、适用样本类型丰富，操作步骤相对简单 

由于核膜稳定性比细胞膜高，因此组织冻存后细胞核膜不会被破坏，因此冻存组织可以提核做SnRNA-seq，提高了单细胞测序的样本类型和实验设计丰富度。

2、降低人为引入的转录偏差 

因为组织可以直接从冻存状态开始抽核，此状态下细胞转录活动已经被抑制并固定，因此不会再发生转录状态改变，结果真实性提高。

3、相对提高细胞类型的全面性 

直接冻存状态下对细胞进行机械破碎或者化学破碎，不会再出现酶解法引入的解离偏好性，相对而言细胞回收的全面性更高。通过比较分析了肾脏组织利用dropseq和10x两种平台的ScRNA-seq和SnRNA-seq的区别，发现SnRNA-seq的结果中包含了很多在scRNA中不存在的细胞类型，肾小球足细胞的比例增加了20倍【14】。

SnRNA-seq的劣势

虽然SnRNA-seq相比较ScRNA-seq具有多方面的优势，但同样SnRNA-seq的劣势也比较明显：

1、检测到的基因少 

SnRNA-seq只能检测细胞核中的mRNA, 缺失对细胞质中的mRNA分子的检测。同时由于细胞核中带有polyA尾的成熟mRNA比例更低，因此对于某些样本而言，采用SnRNA-seq每个细胞核中检测到的基因会偏少，不利于细胞亚型的鉴定。

2、获得免疫细胞较少 

虽然上文提到SnRNA-seq可以提高细胞检测的全面性，但是其在某些细胞类型的再现上并没有优势。2020年发表在Nature Medicine的一篇文章【15】，对不同肿瘤类型的新鲜/冷冻样本进行ScRNA-seq和SnRNA-seq， 结果显示两种方法检测到的细胞类型相似，但比例差别较大：在神经母细胞瘤中， 相比SnRNA-seq，ScRNA-Seq中免疫细胞比例更高，神经嵴、神经内分泌细胞等实质细胞大幅减少；而SnRNA-Seq结果中实质性细胞（尤其是恶性细胞）比例更高，但是T细胞大幅减少，B细胞和NK细胞基本消失，内皮细胞、上皮细胞增加。

总结

总体而言，若针对冻存样本、细胞直径大于40um以及相对较难解离的植物样本，建议采用SnRNA-seq；一些较难解离的动物样本，派森诺的单细胞研发团队可提供一对一个性化的解离方案，让科学研究多一种选择。某些具体情况，则要根据研究目的进行个性化地调整。例如，关注肝癌样本中的肝实质细胞，SnRNA-seq是更佳的方案；关注肝癌样本中的免疫细胞，ScRNA-seq是更加方案。若关注肝癌样本中的肝实质细胞和免疫细胞，则可联系您身边的派森诺销售，让派森诺的资深技术支持，提供个性化的实验方案。

参考文献：

1、Defining cell types and states with single-cell genomics

2、Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations

3、A single-nuclei RNA sequencing study of Mendelian and sporadic AD in the human brain

4、Alzheimer's Patient Microglia Exhibit Enhanced Aging and Unique Transcriptional Activation

5、A Spatiomolecular Map of the Striatum

6、Cells of the adult human heart

7、Transcriptional heterogeneity of fibroblasts is a hallmark of the aging heart

8、A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys

9、Complementary Roles for Single-Nucleus and Single-Cell RNA Sequencing in Kidney Disease Research

10、Single-Nuclei RNA Sequencing Assessment of the Hepatic Effects of 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin

11、Characterizing the Heterogeneity of Liver Cell Populations Under a NASH-Related Hepatotoxicant Using Single-Nuclei RNA Sequencing

12、Plasticity of Epididymal Adipose Tissue in Response to Diet-Induced Obesity at Single-Nucleus Resolution

13、SnRNA-seq reveals a subpopulation of adipocytes that regulates thermogenesis

14、Advantages of Single-Nucleus over Single-Cell RNA Sequencing of Adult Kidney: Rare Cell Types and Novel Cell States Revealed in Fibrosis

15、A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors