​干细胞3D微载体规模化生产工艺和质量控制（下）

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质量控制节点和检验项目

传统的二维细胞培养，耗费人力、耗材、时间等成本较大，对操作人员要求较高，操作过程繁琐开放，容易造成细胞质量异质性大、批次间稳定性差和引入外源污染等诸多问题。

3D微载体生物反应器扩增技术，是标准化制备均一性高质量细胞的主要解决方案。目前阶段，干细胞（以MSCs为代表）关键质量属性均是基于二维培养方式研究和设定的。然而，采用微载体在生物反应器中大量扩增MSCs时，细胞培养环境由静态转变为动态，细胞的粘附介质由贴壁培养皿/瓶转变为不同材质的微载体，培养过程中营养物质的消耗和细胞代谢成分与常规贴壁培养差异显著，细胞传代扩增收获方式不是简单的胰酶消化传代，这些因素所涉及的培养环境或条件的改变均显著影响MSCs的细胞活性、生物学特性以及遗传稳定性等。

在细胞监管和质量评价机构尚未出台基于三维动态扩增细胞质量评价标准前，我们仍以现行的二维培养MSCs细胞质量评价项目及标准作为微载体培养工艺的质检标准。同时由于微载体的介入，即便是可溶性微载体，如何保证微载体残留物在细胞终产品中符合临床应用安全性标准，也是细胞规模化制备过程中质量控制所需要考虑的问题。

基于以上因素，现阶段华龛3D微载体的规模干细胞制备工艺生产的MSCs质量评价标准，以传统二维细胞培养工艺的MSCs质量检测项目为基本要求，结合3D TableTrix^®微载片可降解的特性，增加了微载体残留及裂解液残留检测作为细胞安全性评价指标，如下图所示。

传统二维培养法，培养基添加基本属于过量使用，每一代细胞的培养过程中基本不需要更换培养基，也不需要检测葡萄糖、谷氨酰胺等营养物质的消耗。

在3D微载体动态培养过程中，由于相对短的时间内会有大量的细胞增殖，通常需要进行周期性的培养基更换；同时考虑MSCs培养过程中的分泌因子对于细胞的增殖也有重要作用。因此，培养基的更换和添加不能完全去除或者稀释这些分泌因子以对细胞增殖率产生显著影响。

在质量控制节点上，根据工艺参数（细胞的类型、二维培养特性、细胞起始接种数目及接种效率，以3D动态培养过程中的DO值、葡萄糖含量、PH等）指标变化，选取合适时间点抽样质检，检测MSCs的基本生物学特性等指标，作为培养基去除/添加，生物反应器培养体系是否放大的依据。

MSCs的体外扩增培养，随着培养时间的延长会出现复制衰老，过度扩增还可能伴随着基因组的不稳定性。尽管不同组织来源的MSCs的代次对于细胞的基因组稳定性影响不尽相同，但传统二维MSCs培养，仍认为临床应用的最佳细胞代次在4-6代。但即便是相同组织来源、相同代次的MSCs，由于不同操作工艺，每一代细胞体外培养时间不同，细胞单层融合后分离培养次数不同，这种细胞二维培养工艺中按照固定的传代比率，以胰酶消化一次计为细胞一代次的方式，并不能真实反映细胞的扩增倍数和细胞复制性衰老的关系。

因此，在3D微载体扩增工艺中，我们采用与细胞二维培养传代相近的细胞倍增时间（在生长曲线上细胞数量增加1倍的时间，Population doubling time，PDT）、细胞群体倍增水平（细胞自体外培养一段时间后的群体倍增数，Populationdoubling level，PDL）来设计MSCs的起始接种浓度和细胞收获时间，以保证收获的MSCs处于高质量高活性状态。此外，我们还应关注MSCs短时间内大量扩增所带来的细胞衰老及基因组稳定性的问题，不能简单的以细胞活率和增殖倍数来评价大规模扩增工艺。

微载体不仅要满足各类干细胞的粘附和增殖要求，还要考虑细胞达到预期增殖数量之后，如何去除微载体。在保证细胞治疗产品的安全性情况下，进行细胞收获操作，且收获的细胞满足干细胞的基本生物学质量要求。  

 

华龛生物开发的微载体裂解液   （3DFloTrix® Digest微载体裂解液）   可特异性降解3D TableTrix   ^®   微载片，将微载体降解为氨基酸片段。为了保证降解后产物   （微载体残留物、裂解液残留物）   在最终的干细胞悬液中符合细胞制品的安全性标准，从原材料的选择、检验方法的建立及安全性评价三个方面进行了质量控制并设定了相应质量标准。  

 

微载体原材料选用药用辅料级别，3D TableTrix   ^®   微载片获得了国家药品审评中心（CDE）药用辅料资质备案（F20210000003与F20210000496），同时也完成了美国FDA/DMF药用辅料资质备案（DMF：35481）。   完成了第三方机构质量检测及安全性评价：   “微载体质检安评报告”（江苏省药物安全性评价中心）、   “微载体残留及裂解液残留质量评价报告“（中国食品药品检定研究院）。   在此基础上，建立了检测微载体原料中特异氨基酸及裂解液中酶活性的残留物检测方法及标准。  

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文末小结  

干细胞3D微载体规模化生产工艺是细胞产品商业化的发展方向。   与二维培养方式相比，干细胞在3D微载体所构成的微环境中更接近于生理组织的环境，无论是细胞尺寸、分泌因子、细胞分化能力等方面，均比单层培养的细胞更具优势，且可以增强MSCs的生物学功能。已有多项研究表明，MSCs在三维培养条件下，其表面标记物、免疫调控能力、表观遗传学特征等均较二维培养细胞发生了明显变化。  

 

因此，现有的基于二维培养工艺的MSCs质量评价标准和方法并不能完全适用于3D微载体规模化生产细胞的质量评价。我们需要建立更能真实反映干细胞三维培养关键质量属性的检验方法和标准，结合各种新技术的运用，在细胞治疗产品的制备生产过程中，实现质量源于设计   （Qualityby Design，QbD）   。