GABAA受体β3亚基敲除的斑马鱼对麻醉药物敏感性的研究

【据《Anesthesiology》2019年12月报道】题：GABA_A受体β3亚基敲除的斑马鱼对麻醉药物敏感性的研究（作者：杨笑萱等）

g -氨基丁酸A型（GABA_A）受体是哺乳动物脑中主要的抑制性神经递质受体，也是多种全身麻醉药物的作用靶点，包括丙泊酚、依托咪酯、巴比妥类药物、卤化挥发性剂和醇类等。GABA_A受体是由5个亚基组成的配体门控氯离子通道，目前已鉴定出的亚基有19种（a1-6，b1-3，g1-3，d，e，q，p和r1-3）。大多数神经元的GABA_A受体包含两个a亚基和两个b亚基以及g、d或另一个b亚基。每个亚基均由一个细胞外结构域、跨膜结构域以及胞内结构域组成。在典型的abg型GABA_A受体中，依托咪酯、丙泊酚和戊巴比妥的结合位点是β亚基的跨膜结构域，而这一结构域在斑马鱼、小鼠和人类中100％保守。

转基因小鼠的研究表明，依托咪酯、丙泊酚和戊巴比妥的麻醉作用是由GABA_A受体的b3亚基介导的。与野生型（WT）小鼠相比，系统性b3亚基敲除（b3-/-）的小鼠对依托咪酯和丙泊酚的镇静催眠作用的敏感性降低，对异氟烷的敏感性基本不变，而对戊巴比妥和乙醇的麻醉效果不受影响。此外，全神经元b3亚基敲除的小鼠也表现出较高的新生儿死亡率，和对依托咪酯麻醉作用的抵抗性。另一种b3亚基点突变的转基因小鼠模型（N265M），消除了来自其他亚基的补偿作用，其表现为对羟-5a-孕烷二酮和乙醇麻醉的敏感性没有变化，但对依托咪酯、丙泊酚和戊巴比妥的麻醉作用的敏感性显著降低，表现为对其翻正反射消失作用的抵抗。这些研究均提示了b3亚基在介导全身麻醉中的特异性。

斑马鱼是近年来新兴的椎体类模式动物，幼龄斑马鱼可以通过皮肤渗透和鳃呼吸，吸收其所处水环境中的药物，在达到平衡状态后，体内药物浓度就等于环境药物浓度，避免了在小鼠腹膜内或静脉注射后复杂的药物药代动力学而引起的药效变化；而且视频分析软件可同时评估许多斑马鱼的行为，节省大量的时间、精力和药物。此前，来自上海瑞金医院麻醉科的于布为教授，和美国哈佛大学医学院附属麻省总医院的Stuart A. Forman教授联合开发出基于幼龄斑马鱼的全身麻醉药物高通量筛选平台，并发现了一种新型全麻药物，引起业界的高度关注和评价。而且，转基因斑马鱼已经成为研究包括癫痫和睡眠疾病在内的神经系统疾病的可靠模型，提示转基因斑马鱼或可成为研究全身麻醉药物作用机制的利器。

基于以上研究基础，该团队利用CRISPR-Cas9基因编辑技术建立了b3-/-斑马鱼品系，并测试了其生育能力、存活情况、颅面部形态、活动能力以及对一系列麻醉药的镇静催眠作用的敏感性。研究首先利用基因测序证实b3-/-斑马鱼无法编译出b3蛋白，进一步用爪蟾卵母细胞的电生理发现，野生型斑马鱼的b3基因可以编码被异丙酚和依托咪酯激活的离子通道，而b3-/-斑马鱼的基因则不能，充分证实了b3-/-的基因型。与野生型相比，b3-/-斑马鱼的形态和生长发育相似，但活动度更高，表现为游速更快。依托咪酯、丙泊酚、和戊巴比妥使b3-/-斑马鱼麻醉的EC₅₀值显着高于野生型斑马鱼[依托咪酯1.3（1.0～1.6）vs. 0.6（0.5～0.7）μM； P <0.0001]，丙泊酚[1.1（1.0～1.4）vs. 0.7（0.6～0.8）μM； P = 0.0005]，戊巴比妥[220（190～240）vs. 130（94～179）μM； P = 0.0009]，但乙醇的EC₅₀降低[150（106～213）vs. 380（340~420）mM； P <0.0001]，而羟-5a-孕烷二酮、氯胺酮、MS-222、右美托咪定和丁醇的麻醉效果不受影响。

以上结果表明，b3-/-斑马鱼对镇静催眠药物选择性地不敏感，这与先前在转基因小鼠中报道的结果相同，表明含有b3亚基的GABA_A受体作为麻醉药物作用靶点在系统发育上是高度保守的。鉴于斑马鱼被越来越多的用于神经回路研究，转基因斑马鱼可能有助于揭示特定神经回路中的特定靶点在全身麻醉中的作用，成为研究全麻机制的有价值的模型。

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