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间充质干细胞治疗（三）：质控体系

2020

09/22

干细胞者说

A-

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有效的质量控制方法和标准，是干细胞临床安全性和有效性的基础和前提。

撰文：步步先生

来源：干细胞者说

上一期我们简述了我们简单介绍了间充质干细胞的生产工艺，包括平皿制造工艺和生物反应器制造工艺。开发者可以根据 MSCs 细胞药物的自身特性（如自体/异体，剂量，剂型，规模），选择合适的生产工艺。

作为细胞产品，必须确保进入临床的每一剂细胞质量都是可靠的。有效的质量控制方法和标准，是干细胞临床安全性和有效性的基础和前提。本期，我们将针对间充质干细胞的质控体系展开论述。

间充质干细胞的质控体系总览

无论是平皿制造工艺还是生物反应器制造工艺，作为MSCs产品，都必须确保每一代细胞质量是均一稳定的。自 MSCs 产品进入临床转化以来，研究人员开发了很多方法来评估这些细胞产品的质量（比如：无菌性，安全性，纯度，活性，鉴定，稳定性）。

图1. 间充质干细胞的质控体系总览（横屏观看）

间充质干细胞质控体系论述

我们下面将讨论，在 cGMP环境下如何进行 MSCs 产品的质量控制。

无菌检测

对微生物的检测，始终应贯穿整个细胞制备过程（包括起始组织、中间产品<如脂肪组织的SVF>、每一代细胞的培养扩增、冷冻前、最终产品等阶段）。传统的检测方式，耗时比较长，满足不了细胞产品的时效性。作为替代，高效且自动化微生物检测系统横空出世（比如BacT/ALERT 和BACTEC，已获美国FDA批准），可在一周内检测真菌，厌氧菌，需氧菌。

同样，使用 PCR 法或其他方法检测支原体，也应该始终应贯穿整个制备过程的细胞或其培养上清里面。使用鲎试剂定量检测细胞产品里的内毒素含量。

安全性

致瘤性是细胞治疗需要注意的一个重要风险。一般认为，致瘤性与多能干细胞（如 ESC 和 iPSC ）相关，但使用成体干/祖细胞（比如 MSCs ）前也需要进行广泛的安全性测试。虽然近二十多年来的临床试验里，尚未发生间充质干细胞致瘤的案例。

一般染色体异常检测的质控要求是标准 G 带核型分析。有人建议，可以用CGH（比较基因组杂交）、FISH（荧光原位杂交）或PCR技术检测肿瘤的表达。体外长期扩增可能会导致基因组突变，但并无证据表明衰老与 MSCs 恶性转化有关。但出于安全和细胞效力考虑，建议尽量避免使用可能衰老的细胞。

通常，MSCs在衰老前，可在体外进行20~40倍扩增。Barkholt 等[1]人建议尽量减少 MSCs 体外扩增倍数，以降低染色体异常的可能性。ADIPOA-2临床试验，就将最终产品扩增倍数限制在7.2倍内，细胞代数从p1-p16。

细胞活性

关于细胞活性检测，目前使用最广泛的评估方法是台盼蓝染色实验（其中，活细胞和非活细胞是手工计数的），其机理是细胞膜完整可以代表活性。此外，还有自动化计数仪。这种方法简单且成本低。但如果样本量很大，耗时较长。这种方法不能检测早期凋亡细胞（细胞死亡一般发生在解冻后，可能不太明显，这种现象叫：低温诱导细胞延迟性死亡[2]）。Annexin V/PI 共染色的方法能更准确地评估细胞活性（流式细胞仪分析细胞凋亡）。

对于 MSCs 产品的大多数监管要求，一般新鲜细胞产品活率 ≥ 90%；冷冻细胞产品，一般解冻后细胞活率 ≥ 70%。

细胞表面标记物

2006年，国际细胞治疗学会（ISCT）提出 MSCs 的最基本定义，即在塑料器皿培养条件下，呈贴壁生长；有一定的表面标记物，表达CD105、CD73和CD90，不表达CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79α或CD19及HLA-DR表面标记；体外可以向成骨，成脂肪，成软骨分化。

众所周知，MSCs 的生物学效力和增殖特性，随着传代次数的增加逐渐下降，而标准表面标记物 CD73、CD90和CD105 在传代的早期和晚期均稳定表达，这些标记物也并非 MSCs 特有的。不同的表面标记物可能代表 MSCs 不同的潜能。

表1. 不同表面标记物可能代表 MSCs 的不同潜能[3]

因此，MSCs 鉴定的表面标记物存在一定缺陷，不能满足 cGMP 生产和临床转化的需求。为了更好的标准化生产，我们需要寻找新的 MSCs 细胞表面标记物显示出 MSCs 的特定表征，以便可以预测细胞产品的治疗性能。

产品纯度

MSCs 产品的纯度不仅影响安全，在一定程度上还影响疗效。产品杂质主要是与细胞制备相关的残留污染物（包括添加成分或降解产物，如残留蛋白质、细胞因子、血清、抗体或酶）。虽然已可以通过工艺控制（如稀释、离心和清洗等步骤），使得产品中杂质的浓度降低甚至忽略不计，但仍需要对残留污染物进行定量分析，确保其含量处于人体可承受范围。

除了分子污染物，还有其他非 MSCs （比如CD45+细胞就不属于MSCs）的细胞混杂污染。应通过对 MSCs 表面标志物的检测，来评估MSCs产品的纯度。

稳定性

细胞是活的药剂，对周围环境高度敏感，因此需要一个严格控制的环境，以确保产品（安全，无菌，表面标记物，活性，纯度和效力）的公认标准都得到保证（从细胞收获到给病人使用的时间）。这就需要考虑到储存和运输条件。

4℃条件下，在0.9%生理盐水中，鲜活的 MSCs 可保存高达6个小时（细胞活率≥90%）[4]；另一些报道说，如果通过改变辅料配方，可以在4℃条件下保存延长至48个小时，同时细胞损失不大[5]。但又有人发现，在4℃生理盐水中，MSCs 的增殖和分化能力随之下降，2小时内克隆形成能力（CFU-F）下降50%，三系分化潜能显著降低[6]。

不论如何，MSCs 产品生产完成后，需要尽可能快运输至临床实施。若细胞制备基地与临床距离较远时，产品制备后应先冻存，运至在临床再解冻，解冻后要迅速给药，否则细胞的死亡率将会上升。

文末小结

本期内容，我们简单介绍了间充质干细胞的质控体系，贯穿于细胞生产工艺的每个环节，包括组织采集，细胞分离、扩增、收获，以及产品放行。每个生产环节，都需要相应的质量控制方法和标准。