从副产物中发现新一代最强PARP抑制剂

聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly (ADPribose) polymerase,PARP]催化聚腺苷二磷酸核糖（PAR）的形成，涉及众多生物进程，如基因组完整性检测、细胞周期进程、DNA损伤修复启动、凋亡及转录调节等。

在PARP家族成员中，PARP1和2在DNA单链断裂修复中扮演关键角色。

PARP1是一种丰富的核蛋白，可以检测断裂的DNA链，并通过其N端锌指结构域与受损的DNA结合，从而激活C端催化结构域，水解NAD+生成PAR聚合物。这种聚-ADP-核糖基化过程促进了DNA修复蛋白募集至DNA断裂位点，随后通过碱基切除修复方式进行修复。PARP2也存在于细胞核中，其功能与PARP1相似，但含量相对较少，仅占PARP总活性的5% - 10%。

大多数PARP抑制剂为烟酰胺的类似物，如奥拉帕尼（olaparib;olaparib）、尼拉帕尼（niraparib；Tesaro/Merck）、维利帕尼（veliparib；AbbVie）、他拉唑帕尼（talazoparib；BioMarin/LEAD/Medivation）（实例化合物均已上市或处于临床I//II期）。

这些PARP抑制剂不仅与替莫唑胺和拓扑异构酶抑制剂等DNA损伤剂联合使用显示抗肿瘤活性，而且它们中的许多还显示出单剂量疗效。

值得注意的是，除了抑制PARP1和PARP2的催化活性外，某些PARP抑制剂还可将PARP蛋白“捕获”到DNA上，干扰DNA的修复和复制。实际上，PARP捕获是PARP杀死癌细胞的主要机制。

拜玛林制药（BioMarin Pharmaceutical, BMRN）以偶然得到的副产物为重要中间体获得先导，对先导进一步优化最终发现了BMN673（Talazoparib, Pfizer）。Talazoparib于2018年获FD批准，用于治疗局部晚期或转移性乳腺癌。

从副产物中间体到先导

化合物5是拜玛林制药公司早期研发的PARP抑制剂，最初的合成计划是从4-硝基异苯并呋喃酮6开始，通过中间体7和8制备酞嗪酮中间体9，随后通过上溴和环化反应后生成化合物5。

然而将化合物7转化为8时，多次尝试，无法得到产品。

核磁谱图及质谱显示主要的产物为全新结构的12（该化合物的生成涉及到三个意料之外的级联反应，如机理图）。

研究人员意识到，通过将肼与酮酯部分环合得到的化合物可能成为潜在的PARP抑制剂。这类环合的三环四氢吡啶并酞嗪酮核心母核，可能与其他现有的PARP抑制剂一样，为PARP酶的烟酰胺结合位点提供氢键和π-堆积相互作用。

正如猜测，环化后得到的化合物13的PARP酶活性达到了惊人的6.1nM。然而其细胞活性相对较弱（GI50＞300μM），需要进一步优化。

先导优化

为了提高化合物的溶解性和细胞活性，首先将8和9位的苯环替换为芳香杂环，但是激酶活性大大下降，此外，将苯环替换为非芳香性的取代基，活性也下降。因此研究者保留了苯环，并在苯环上作出取代。

结果显示8位苯基的取代优于9位苯基的取代，其中化合物15虽然体外活性较好，但是代谢并不稳定，推测为9位苯基的对位存在羟基化，因此在对位引入不同的取代基，堵住了代谢位点，代谢得到一定程度的改善。

为了进一步提高代谢稳定性，在9位引入唑类取代苯环，在8位的对位引入F等取代基堵住代谢位点，代谢得到进一步提高，且活性得到保持，同时值得注意的是，在5位引入F相对其他体积更大的取代基活性最佳。而43和45的对比发现，三唑结构的微小变化将导致25倍的细胞活性差异，因此，基于该SAR结果，研究者集合所有的优势取代，在5位引入F，在8位苯基对位引入F，在9位引入1-甲基-1,2,4-三唑，由此产生了活性最强的化合物47。

外消旋体手心拆分

母核上8,9位的同时取代产生了两个手心中心，因此研究者优选了部分化合物进行手性拆分（顺式异构体活性低，且差率低，因此未探讨顺式异构体）并评价其体外活性，结果表明对映异构体中（8S,9R）总是优于（8R，9S）的，这表明化合物在PARP激酶中的相互作用是存在立体定向性的。

此外，活性最佳的化合物(8S,9R)-47（BMN673）活性为外消旋体47的两倍，且对PARP1和2具有相同的抑制作用。

BMN673与PARP1相互作用的结构基础

BMN673的氟苯与Tyr889形成π-堆积作用，1,2,4-三唑与Tyr896形成水介导的氢键相互作用，与(8R,9S)-47（分子对接）对比发现，小分子在结合位点显示了清晰的立体定向性。

PK性质

在两个临床前物种中（SD裸鼠和狗），BMN673显示杰出的口服生物利用度，暴露量，合适的半衰期和较低的清除率。同时，BMN673也显示了优良的体外安全性，没有明显的脱靶效应，CYP酶和hERG抑制，较低的致癌性及合适的血浆蛋白结合。

体内抗肿瘤活性

在MX-1移植模型中，单次口服1mg/kg(8S,9R)-4724h后，瘤内PAR水平仅仅部分恢复，作为对比，奥拉帕尼口服100mg/kg24后PAR水平完全恢复。

在BRCA1缺陷的MX-1乳腺癌移植模型中，(8S,9R)-47,0.33mg/kg一天一次口服给药明显抑制肿瘤生长，六只小鼠中四只实现了肿瘤的完全消退。

一天一次口服(8S,9R)-47终止给药后，肿瘤开始出现恢复，因此研究者尝试一天两次口服给药，结果显示，一天两次0.165mg/kg口服给药，所有给药老鼠均实现肿瘤消退，且停药5周不见肿瘤复发。

此外，(8S,9R)-47与顺铂联用证明了剂量依赖性的增敏作用，且明显加强卡铂的抗肿瘤活性

总结

Talazoparib是迄今为止最强的PARP抑制剂，其区别于以前的PARP抑制剂，可以以低得多的浓度发挥疗效（在BRCA1缺陷的MX-1细胞中其EC50比奥拉帕尼低50倍，在BRCA1缺陷的Capan-1细胞中，其EC50比维利帕尼低2000倍），Murai等研究显示，BMN673是一个强效PARP-捕获抑制剂，这可以解释其区别于其他PARP抑制剂的显著提高的抗肿瘤活性。

参考文献

Bing Wang, et al. Discovery and Characterization of (8S,9R)-5-Fluoro-8-(4-fluorophenyl)-9-(1-methyl-1H-1,2,4-triazol-5-yl)-2,7,8,9-tetrahydro-3H-pyrido[4,3,2-de]phthalazin-3-one(BMN 673, Talazoparib), a Novel, Highly Potent, and Orally EfficaciousPoly(ADP-ribose) Polymerase-1/2 Inhibitor, as an Anticancer Agent. J. Med.Chem. 2016, 59, 1, 335–357.