肠道菌群在肿瘤治疗中的作用

外源微生物在肿瘤发生中的致癌作用、在肿瘤发展中的促进作用已经有较多报告，某些病毒、细菌及寄生虫被确定为某些肿瘤的高度危险因素。de Martel C等^[1]报告：2008年全球一共有肿瘤新发病例1270万，其中因感染导致的肿瘤约200万，占16.1%，提示人类六分之一的肿瘤起源于微生物感染^[1]。经济不发达地区，感染因素导致的肿瘤比例更高，撒哈拉以南非洲地区高达32.7%的肿瘤与感染有关。在所有的致瘤微生物中，以幽门螺旋杆菌、B及C型肝炎病毒、人类乳头状瘤病毒导致的肿瘤最高，约190万。

内源细菌----肠道菌群（gut microbiota）在肿瘤发生发展及治疗中的作用是近年来肿瘤研究的一个热点领域。尽管致病性是一些微生物的本质特征，但是研究发现，共生微生物（commensal microbes）只有在机体免疫环境偏离稳态（homeostasis）时才会致病。宿主遗传缺陷或后天因素导致的炎症失调及菌群失调（dysbiosis）将共生微生物由共生生物（symbiont）变为病理生物（pathobiont）^[2] 。另一方面，最近的研究发现：肠道微生物群不仅不是致癌因素，反而是抗癌因素，肠道菌群有益于肿瘤治疗，在肿瘤本身或其并发症的治疗中发挥重要作用。

1.过继免疫治疗

通过大剂量化疗或全身照射（total body irradiation，TBI）清除体内抑制性淋巴细胞，激活先天性（非特异性）免疫系统，增加稳态细胞因子（homeostatic cytokine）水平，促进肠道菌群移位，升高血浆LPS水平，可以有效提高抗肿瘤CD8+T细胞过继性细胞输入（adoptive cell transfer，ACT）的成功率。淋巴细胞清除强度愈大，CD8+T细胞产生的抗肿瘤效果也愈好。这种治疗在50%~70%的黑色素瘤患者中产生客观性的抗肿瘤效果。Paulos CM等[3]发现：用抗生素减低宿主肠道菌群、用多粘菌素B 中和血浆LPS水平、或用CD14和TLR4遗传缺陷小鼠去除LPS或 LPS 信号组件（signaling components）均会显著降低TBI的肿瘤抑制作用。相反，给未经TBI小鼠输注含微生物配体（microbial ligand）血浆或TBI小鼠的纯LPS，可以增强CD8+细胞激活，促进肿瘤萎缩。给TBI小鼠输注纯LPS可以进一步提高ACT的CD8+T细胞数量及功能，导致荷B16F10瘤小鼠的长期治愈。用环丙沙星（Ciprofloxacin）治疗TBI荷瘤小鼠，降低了小鼠血浆LPS水平、减少了小鼠树突状细胞（dendritic cell，DC）绝对数量，抑制了先天性免疫系统的激活，从而削弱了ACT治疗效果，(图1)。提示肠道菌群在肿瘤细胞免疫治疗中发挥重要作用。

图1 环丙沙星治疗对TBI荷瘤小鼠的影响

†P = 0.05，††P < 0.05 vs. 5 Gy TBI无环丙沙星治疗; ‡‡P < 0.001 vs. 5 Gy TBI 加ACT治疗、无环丙沙星治疗。

环丙沙星治疗降低了TBI小鼠血浆LPS水平；B，环丙沙星治疗减少了TBI小鼠脾树突状细胞（CD11c+CD86high DCs）数量；C，环丙沙星治疗削弱了TBI小鼠ACT治疗效果。引自参考文献3

Cipro，Ciprofloxacin，环丙沙星；DC，dendritic cell，树突状细胞；NT，non treatment，无治疗（特指ACT）；TX，treatment，治疗（特指ACT治疗）。

2.环磷酰胺

环磷酰胺（Cyclophosphamide，CTX）作为一种烷化抗癌药物，大剂量时抑制免疫功能，因此也被用于自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮、风湿性关节炎等；小剂量时则相反，抑制T调节细胞功能，从而增强免疫应答功能；此外，CTX还可以诱导免疫细胞死亡，活化抗肿瘤获得（特异）性免疫，从而有助于CTX的抗肿瘤作用。

肠道菌群对化疗效果的影响已经由抗生素杀灭肠道菌群、改变共生菌群（commensal microbiota） 、无菌（germ-free，GF）条件下养育小鼠实验所证实。把GF小鼠转换到无特定致病菌（specific pathogen-free，SPF）条件下养育，小鼠获得了一个健康的、多样化的菌群，进而促进了先天性和获得性免疫系统的发展与分化。T辅助17（T-helper 17，Th17）细胞在肠道黏膜屏障及自身免疫性疾病的发生中具有关键作用，Th17细胞的出现依赖于菌群的定植，Yang Y等[4]人报告分段丝状菌（segmented filamentous bacteria，SFB）是肠道黏膜固有层Th17细胞分化的强烈诱导剂，可以促进Th17细胞依赖性自身免疫性疾病。

Viaud S等[5]人给不同小鼠接种相同的MCA205肉瘤并给予CTX治疗，发现：与荷瘤SPF小鼠相比，荷瘤GF小鼠对CTX治疗不敏感；与未经抗生素治疗的荷瘤小鼠相比，万古霉素杀灭G+细菌的荷瘤小鼠对CTX治疗反应性下降，脾脏致病性T辅助17（pathogenic T helper 17，pTh17）细胞聚集减少。过继性输入pTh17细胞，可以有效增强CTX的抗肿瘤效果，提示肠道菌群可以影响抗肿瘤免疫反应。

Perez-Chanona E和Trinchieri G[6]认为：CTX抗肿瘤作用的机制部分地是通过改变小肠菌群、促进某些特定G+细菌移位实现的。这些移位的G+细菌刺激了pTh17细胞亚群的产生，激发Th1细胞免疫反应，唤醒机体抗肿瘤特异性免疫反应。

3.铂盐

草酸铂（Oxaliplatin）与顺铂（cisplatin）通过结合DNA、引起链内交联加合物（intrastrand crosslink adducts），损坏DNA，激活致凋亡通路，诱导肿瘤细胞凋亡。Iida N等[7]报告：用抗生素治疗皮下接种EL4淋巴瘤小鼠，草酸铂诱导的DNA损坏减轻、ROS基因表达减少，提示抗生素治疗削弱了铂盐的抗肿瘤效果。与SPF小鼠相比，GF小鼠对铂盐的治疗反应明显降低，说明铂盐的作用依赖肠道菌群。研究还发现：髓系细胞释放的ROS对草酸铂诱导的DNA损坏贡献巨大。髓系NADPH氧化酶NOX2先天性不足的Cybb -/-小鼠，由于ROS反应迟钝，他们对草酸铂治疗耐药。作者认为：草酸铂的疗效依赖于肠道菌群激活髓系细胞、后者释放ROS，发挥基因毒性（genotoxicity）和肿瘤减灭作用。

4.CpG寡核苷酸和抗白介素10抗体

Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）蛋白属于动物模式识别受体家族，先天性免疫系统依靠TLR 9监测微生物DNA中未甲基化CpG基序的出现。微生物DNA中一旦出现未甲基化CpG基序， CpG寡核苷酸（oligonucleotides，ODN）即与浆细胞样树突状细胞及B细胞上的TLR 9结合，TLR 9诱导上述细胞表达致炎细胞因子，从而增强机体免疫反应[8]。临床研究显示：单独使用CpG-ODN没有抗肿瘤疗效，但是将CpG-ODN与肽疫苗一起使用时，可以增强抗肿瘤免疫反应。与人类不同，小鼠TLR 9广泛分布于所有髓系细胞。瘤内注射CpG-ODN时，特别是与抗白介素10抗体（anti-interleukin-10 antibodies，a-IL-10 ab）联合使用时，可以有效治疗移植肿瘤。CpG-ODN通过刺激释放致炎细胞因子，包括TNF，诱导肿瘤快速出血坏死，继而诱导获得性抗肿瘤免疫反应。GF小鼠、抗生素治疗小鼠对上述治疗抵抗。以CpG ODN/a-IL-10 ab治疗菌群缺乏小鼠，髓系细胞IL-12和TNF表达减少，而这些细胞因子是CpG-ODN诱导出血坏死所必需的。给菌群缺乏小鼠注射TLR 4配体、LPS，可以恢复CpG ODN/a-IL-10 ab的治疗反应。改变肠道菌群可以削弱小鼠皮下肿瘤对CpG-ODN及铂盐的治疗反应。提示：寡核苷酸的抗肿瘤疗效同样依赖赖于完整的共生菌群。(图2)

图2 肠道菌群对化疗药物及免疫调节寡核苷酸疗效的影响

CTX治疗导致肠道黏膜上皮不稳定，引起屏障功能破坏、肠道细菌及其产物移位，进而激发系统性变化：包括初始T淋巴细胞（naıve T lymphocytes）分化为致病性T辅助17（pathogenic T helper 17，pTh17）细胞，共表达Th1 (T-bet, IFN-g、CXCR3)和Th17 (ROR-gT、IL-17、CCR6)细胞基因。上述细胞与Th1细胞一起介导了肿瘤免疫细胞死亡。免疫刺激CpG寡核苷酸（oligonucleotides，ODN）招募髓系细胞中的TLR9，诱导TNF产生，结合抗白介素10抗体（anti-IL-10 antibodies，a-IL-10 ab）的抑制效应，进而引起炎症反应，导致肿瘤出血性坏死。草酸铂的治疗效果依赖于微生物信号刺激髓系细胞产生活性氧家族（reactive oxygen species，ROS）。铂盐、DNA加合物及ROS诱导DNA破坏，导致肿瘤细胞凋亡。引自参考文献6

CTX，Cyclophosphamide，环磷酰胺；CpG ODN，CpG oligonucleotides，CpG寡核苷酸；ROS，reactive oxygen species，活性氧家族； a-IL-10 ab，anti-IL-10 antibodies，抗白介素10抗体。

肠道微生态系统的不同菌群在CpG ODN/a-IL-10 ab治疗中作用不同[6]。粪便中的G- Alistipes 菌属丰富与肿瘤TNF产量正相关，Lactobacillus菌属丰富则与肿瘤TNF产量负相关。用Alistipes shahii重建抗生素治疗小鼠的肠道微生态系统，肿瘤瘤体里面分泌TNF的髓系细胞数量显著多于未重建微生态的抗生素治疗小鼠，与未接受抗生素治疗的小鼠相当。相反，给普通小鼠胃内灌注Lactobacillus fermentum显著降低了TNF反应。

5.免疫检查点抑制剂

免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors，ICI），特别是抗淋巴细胞相关抗原4单克隆抗体（monoclonal antibodies against lymphocyte-associated antigen 4，CLTA-4）和程序性细胞死亡蛋白1（programmed cell death protein 1，PD1）或其配体PD-L1是近年来的研究热点，在进展性黑色素瘤、肾癌及肺癌治疗中表现出显著的临床效果[9]。ICI的作用机制以前更多地集中在免疫系统本身，现在有人关注肠道菌群在其中的作用。Vetizou M等[10]最近报告：抗CTLA-4治疗对GF小鼠、抗生素治疗小鼠的皮下肿瘤无效。究其原因发现：抗CTLA-4治疗诱导肠道黏膜损伤、引起细菌移位及树突状细胞浸润，树突状细胞负责扩增抗CTLA-4治疗的抗细菌作用、抗肿瘤作用，说明肠道菌群通过调节树突状细胞功能部分地控制抗CTLA-4疗效。进一步研究发现：肠道菌群中类杆菌属如B. thetaiotaomicron、B. fragilis、proteobacteria、Burkholderia cepacia的富集可以强化抗CTLA-4疗效。给GF小鼠胃内灌注上述3种细菌、或者用富含Bacteriodes spp.而且对抗CTLA-4治疗反应良好的患者肠道菌群定植GF小鼠、或者用B. fragilis 的LPS免疫GF小鼠，或者过寄性输注在普通小鼠身上经抗CTLA-4诱导出来的B. fragilis 特异性Th-1细胞，均可以逆转GF小鼠的抗CTLA-4治疗不敏感[6]。用B. fragilis和B. Cepacia胃内灌注GF小鼠，还可以减轻黏膜毒性，减少结肠炎[6]。提示调节肠道菌群可以改善抗肿瘤肿瘤效果，防止一些毒副反应[6]。(图3)

图3 肠道菌群在肿瘤免疫检查点阻断治疗中的作用

抗CTLA-4治疗诱导的免疫活化依靠肠道黏膜损伤、菌群失调及特定Bacteriodes spp.移位，后者诱导IL-12 激活、树突状细胞增殖，激活粪杆菌特异性Th1细胞，共同营造一个有利于抗CTLA-4刺激保护性抗肿瘤免疫应答的理想免疫微环境。抗PD-L1的抗肿瘤效应并非严格依赖肠道菌群，但是小鼠肠道菌群中的Bifibacterium spp.可以激活CD11c+树突状细胞，进而提高抗肿瘤效果、抑制肿瘤生长，使抗PD-L1治疗发挥更好的肿瘤控制效果。引自参考文献6

综上所述：

我们可以清楚地看出，肠道菌群在机体免疫系统中扮演重要角色，在肿瘤治疗中发挥重要作用，粪菌疗法（fecal microbiota therapy）[11]也由此应运而生，而实现肠道粪菌治疗的最直接方法是将粪便从一个个体移植到另一个个体，将健康供体液化的粪便引入受体的肠道中，从而使健康的菌群在受体肠道中重新定植。粪菌移植目前已经用于治疗严重的感染性疾病，如难辨梭状芽胞杆菌感染等，与标准抗生素疗法20%的有效率相比，粪菌移植的疗效可以达到85%-90%，粪菌移植展现出绝对优势。此外，粪菌移植目前也在试用于其它疾病如肥胖、糖尿病、肠易激综合征等。鉴于肠道菌群在肿瘤发生发展及治疗中的重要作用，我们有理由相信：不久的将来，粪菌移植将会被用于肿瘤治疗，从而产生一个崭新的肿瘤治疗方法----肿瘤粪菌疗法（Cancer fecal microbiota therapy）。

参考文献

1. de Martel C, Ferlay J, Franceschi S, et al. Global burden of cancers attributable to infections in 2008: a review and synthetic analysis. Lancet Oncol. 2012;13(6):607-15.

2.Perez-Chanona E, Trinchieri G. The role of microbiota in cancer therapy. Curr Opin Immunol. 2016;39:75-81.

3.  Paulos CM, Wrzesinski C, Kaiser A, et al. Microbial translocation augments the function of adoptively transferred self/tumor-specific CD8+ T cells via TLR4 signaling. J Clin Invest. 2007;117(8):2197-204.

4. Yang Y, Torchinsky MB, Gobert M, et al. Focused specificity of intestinal TH17 cells towards commensal bacterial antigens. Nature. 2014;510(7503):152-6.

5. Viaud S, Saccheri F, Mignot G, et al. The intestinal microbiota modulates the anticancer immune effects of cyclophosphamide. Science. 2013;342(6161):971-6.

6. Perez-Chanona E, Trinchieri G. The role of microbiota in cancer therapy. Curr Opin Immunol. 2016;39:75-81

7. Iida N, Dzutsev A, Stewart CA, et al. Commensal bacteria control cancer response to therapy by modulating the tumor microenvironment. Science. 2013;342(6161):967-70.

8. Scheiermann J, Klinman DM. Clinical evaluation of CpG oligonucleotides as adjuvants for vaccines targeting infectious diseases and cancer. Vaccine. 2014;32(48):6377-89.

9. Sharma P, Allison JP. The future of immune checkpoint therapy. Science. 2015;348(6230):56-61.

10. Vétizou M, Pitt JM, Daillère R, et al. Anticancer immunotherapy by CTLA-4 blockade relies on the gut microbiota. Science. 2015;350(6264):1079-84.

11. Konturek PC, Haziri D, Brzozowski T, et al. Emerging role of fecal microbiota therapy in the treatment of gastrointestinal and extra-gastrointestinal diseases. J Physiol Pharmacol. 2015;66(4):483-91.